Följande schema förklarar hur Tandem-MS fungerar. När proverna joniseras (med ESI, MALDI, EI etc.) för att generera en blandning av joner, väljs prekursorjoner med ett specifikt massa-till-laddningsförhållande (m/z) ut (MS1) och fragmenteras sedan (MS2) för att generera produktjoner för detektion. Sekvensen urval-fragmentering-detektion kan utvidgas ytterligare till att omfatta produktjoner av första generationen. Till exempel kan utvalda produktjoner som genereras i MS2 fragmenteras ytterligare för att producera en annan grupp av produktjoner (MS3) och så vidare.
*http://en.wikipedia.org/wiki/Tandem_mass_spectrometry
Tandem MS-instrumentering
Då Tandem MS innefattar tre distinkta steg av urval-fragmentering-detektering, kan separationen av dessa tre steg förverkligas i rummet eller i tiden.
Tandem MS i rymden
Typiska instrument för Tandem MS i rymden omfattar QqQ, QTOF och hybridjonfälla/FTMS etc.
QqQQ (Triple Quadrupole)
* http://www.biologie.hu-berlin.de/gruppenseiten/oekologie/meth/massspec/mass_sp
Tre Quadrupoler (Quad 1, Quad 2 och Quad 3) står uppställda i rad. Prekursorjoner väljs ut i Quad 1 och skickas till Quad 2 för dissociation (fragmentering). De genererade produktjonerna skickas till Quad 3 för massavläsning.
QTOF (Quadrupole Time-of-flight)
* http://www.ucl.ac.uk/ich/services/lab-services/mass_spectrometry/proteomics/technologies/madli
I QTOF väljs prekursorjoner ut i Quadrupolen och skickas till kollisionscellen för fragmentering. De genererade produktjonerna detekteras genom flygtidsmasspektrometri (TOF).
Hybrid jonfälla/FTMS
*http://planetorbitrap.com/orbitrap-velos-pro#tab:schematic
För hybrid jonfälla/FTMS-instrumenten (FT-ICR eller Orbitrap) väljs prekursorjoner ut och fragmenteras i en extern jonfälla. De genererade produktjonerna kan detekteras antingen i den externa fällan (lägre massupplösning, men snabbare) av eller med FTMS (högre massnoggrannhet och upplösning, men långsammare).
Tandem-in-Time MS/MS
Typiska Tandem-in-Time MS/MS-instrument inkluderar jonfälla och FT-ICR MS.
Notering av fragmentjoner
Peptider och oligosackarider (inklusive glykolipider) följer olika nomenklatursystem för sina fragmentjoner. Andra klasser av föreningar, t.ex. fosfolipider osv, har ännu inga etablerade nomenklatursystem.
Peptider
Nomenklatur för peptidfragment
Fragment som innehåller N-terminus märks med a, b eller c, beroende på klyvningsstället, medan fragment som innehåller C-terminus märks med x, y eller z. Siffrorna anger antalet aminosyrarester i fragmentjonen.
Oligosackarider (inklusive glykolipider)
För oligosackarider märks fragment som innehåller den reducerande änden (den reducerande änden är till höger i figuren) med x, y eller z, beroende på klyvningsstället, medan fragment som innehåller den andra änden märks med a, b eller c. Siffrorna anger sockerrestens plats: y-, z-, b- och c-jonerna är fragment som beror på glykosidiska klyvningar (genom att klippa glykosidiska bindningar som håller ihop två intilliggande sockerrester), medan a- och x-jonerna är resultatet av en korsringsklyvning.
Nomenklatur för oligosackaridfragment (inklusive glykolipider, när R = ceramid) (Costello, C. E.; Vath, J. E. Methods Enzymol. 1990, 193, 738-768)
Fragmenteringstekniker
Prekursorjoner kan aktiveras (med ökad intern energi) på många olika sätt. Fragmenteringsmönster beror på hur energi överförs till prekursorjonen, hur mycket energi som överförs och hur den överförda energin fördelas internt. Kollisionsinducerad dissociation och infraröd multifotondissociation är tekniker för ”långsam uppvärmning” som ökar jonens Boltzmann-temperatur och därmed företrädesvis klyver de svagaste bindningarna för att producera främst b- och y-joner. Dessa tekniker är ganska effektiva för peptider, lipider och andra relativt små kemiska föreningar, men kan också avlägsna posttranslationella modifieringar av proteiner (t.ex. fosfater och sockerarter). Elektroninfångningsdissociation och elektronöverföringsdissociation producerar huvudsakligen c- och z-joner samtidigt som posttranslationella modifieringar (PTM) bevaras. ECD och ETD tillämpas därför i stor utsträckning på proteiner och peptider med labila PTMs. För oligosackarider (inklusive glykolipider) kan ECD/ETD också generera korsringsklyvda a- och z-joner, som är avgörande för lokalisering av glykosidbindningar.
Denna teknik kan användas med följande instrument:
- 21 Tesla FT-ICR MS (Actively Shielded)
- 14.5 Tesla FT-ICR MS (Actively Shielded)
- 9.4 Tesla FT-ICR MS (Passively Shielded)
Relaterade publikationer
B. J. Bythell, et al, Relative stability of peptide sequence ions generated by tandem mass spectrometry, Journal of the American Society for Mass Spectrometry 23(4), 644-654 (2012) Läs online
För mer information vänligen kontakta Amy McKenna, Manager, ICR User Program.