I.U.B.: 3.1.27.5
C.A.S.: 9001-99-4
Enzymatisk reaktion (bilden öppnas i ett nytt fönster)
Pankreatiskt ribonukleas (RNas) är ett endoribonukleas. Det katalyserar klyvningen av fosfodiesterbindningen mellan 5′-ribosen i en nukleotid och den fosfatgrupp som är knuten till 3′-ribosen i en intilliggande pyrimidinnukleotid. Denna klyvning bildar en 2′,3′-cyklisk fosfat, som sedan hydrolyseras till motsvarande 3′-nukleosidfosfat.
RNas finns i störst mängd i bukspottkörtel från idisslare (Barnard 1969). Den viktigaste komponenten i det kristallina enzymet är RNas A; en mindre komponent är RNas B. RNas B är den glykosylerade formen av RNas A (Beintema et al. 1976).
Historia:
Jones arbete 1920 brukar anges som ”början” på pankreatiskt ribonukleas (Richards och Wycoff 1971). RNas isolerades av Dubos och Thompson 1938 och kristalliserades av Kunitz 1940.
1947 var Worthington det första företaget som tillverkade höggradigt renat kristallint RNas. I början av 1950-talet framställde företaget Armour rått kristallint enzym och erbjöd det till ett mycket överkomligt pris. Under 1960- och 1970-talen var RNas A en favorit att studera, främst på grund av att det är anmärkningsvärt termostabilt och finns i hög koncentration i en lättillgänglig källa, bovin bukspottkörtel. Dessa studier ledde till att kristallstrukturen kunde klarläggas (Anfinsen 1959, Groves 1966 och Scheraga 1967), aminosyrasekvensen kunde bestämmas (Smyth et al. 1963), den katalytiska mekanismen kunde identifieras (Beers 1960) och veckningsvägar kunde klargöras (Hantgan et al. 1974). RNas A var det första enzymet och det tredje proteinet för vilket en korrekt aminosyrasekvens bestämdes (Raines 1998).
Fyra Nobelpris har tilldelats för arbete i samband med studier av RNas (Anfinsen, Moore, Stein och Merrifield). Den omfattande litteraturen och de många studierna har gjort RNas till 1900-talets mest omfattande studerade enzym (Raines 1998).
Nyligen fortsätter man att undersöka syntesen och mognaden av RNas i det endoplasmatiska retikulumet i levande celler (Geiger et al. 2010). Mycket arbete ägnas också fortfarande åt att studera veckningen och aggregeringen av RNas (Benito et al. 2008, Iwaoka et al. 2008 och Arai et al. 2010). Man studerar enzymets roll i cancerutveckling och genreglering (Shlyakhovenko 2009), och man håller på att utveckla det till kemoterapeutiska medel mot cancer (Chao et al. 2010).
Specificitet:
RNas A är specifikt för pyrimidinnukleosidlänkar (Volkin och Cohn 1953). Reaktionen tros ske i två steg. I det första steget klyvs 3′,5′-fosfodiesterbindningen, samtidigt som en 2′,3′-cyklisk fosfodiesterintermediat bildas. I det andra steget hydrolyseras den cykliska fosfodiestern till en 3′-monofosfatgrupp. Det första steget är ospecifikt med avseende på substratets kvävebas, men det andra steget är absolut specifikt för pyrimidinnukleotider med terminala 2′,3′-cykliska fosfater. RNas B har samma specificitet som RNas A mot både cykliskt cytidylat och jäst-RNA (Plummer och Hirs 1963). RNas A visar en preferens för större substrat (Nogués et al. 1995).
Enzymet klyver vid cytidinrester dubbelt så snabbt som vid uridylrester (Richards och Wyckoff 1971). Thr45 har visat sig vara viktigast för att förmedla pyrimidinspecificiteten, både genom att bilda vätebindningar med pyrimidinbaser och steriskt utesluta purinbaser (del Cardayré och Raines 1994). Asp83:s sidokedja är viktig för att stabilisera övergångstillståndet under klyvningen av uridinhaltiga substrat; denna rest har ingen effekt på kinetiken för cytidinklyvning (del Cardayré och Raines 1995).
Sammansättning:
Proteinets form liknar en njure, med de aktiva platsresterna liggande i klyftan (Richardson 1981, och Raines 1998). Sekundärstrukturen innehåller långa fyrsträngade antiparallella betablad och tre korta alfahelixer (Raines 1998). RNas A innehåller fyra disulfidbindningar som är kritiska för stabiliteten hos det nativa enzymet. Två av dessa disulfidbindningar ligger mellan en alfa-helix och ett beta-blad och bidrar mer till den termiska stabiliteten än de andra två (Klink et al. 2000). RNas B är ett glykoprotein som vid Asn34 innehåller en enda oligosackarid bestående av sex rester mannos och två rester N-acetylglukosamin (Tarentino et al. 1970).
Molekylära egenskaper:
RNas A är ett litet protein, det mogna enzymet har endast 124 aminosyrarester, utan att någon kolhydrat är fäst. RNas A innehåller 19 av 20 aminosyror och saknar endast tryptofan (Nogués et al. 1995 och Raines 1998). RNas A:s tredimensionella struktur är fullständigt kodad av dess aminosyrasekvens (White och Anfinsen 1959 och Raines 1998). Alla åtta mänskliga RNase A-liknande gener finns på kromosom 14. Var och en kodar för en sekretorisk signalsekvens och innehåller en invariant katalytisk triad av två histidiner och en lysin med ett konserverat motiv (CKXXNTF) (Marshall et al. 2008).
Aminosyrasekvenserna för många homologer till RNas A har identifierats, vilket gör RNas A till ett modellsystem för vertebraternas molekylära evolution (Dyer och Rosenberg 2006). Utifrån sekvenserna och deras fördelning över en rad arter har det fastställts att RNas A är ett modernt protein som utvecklas snabbt (Doolittle 1992 och Raines 1998).
Proteinaccessionsnummer: P61823
CATH-klassificering (v. 3.2.0):
- Klass: Alpha-Beta
- Arkitektur: Roll
- Topologi: P-30 Protein
Molekylvikt:
- RNas A: 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNas B: 14,700 ± 0,3 (Plummer och Hirs 1963)
Optimalt pH: RNase A: 7,0-7,5 (Brown och Todd 1955)
Isoelektrisk punkt:
- RNas A: 9,3 (Ui 1971)
Extinktionskoefficient:
- RNas A och B: 8 640 cm-1M-1 (teoretisk)
- RNas A: E 1%, 280 = 7,3 (Worthington RNas A)
- RNas B: E 1%, 280 = 5.77 (Teoretisk, RNas B)
Aktiva platsrester:
- Histidin (H12, H119)
- Lysin (K41)
Aktivatorer:
- Natriumklorid (Weickmann et al. 1981)
- Sulfat (Moosavi-Movahedi et al. 2006)
Inhibitorer:
- Tungmetalljoner
- Ribonukleashämmare (RI), ett 50 kDa protein som utgör ≤ 0.01 % av proteinet i cytosolen i däggdjursceller (Takahashi 1967)
- Uridin-vanadatkomplex (Lindquist et al. 1973)
Användningar:
- RNA avlägsnas under DNA-isolering
- RNA-sekvensanalys
- RNaskyddsanalyser
- RNA-kvantifiering eller kartläggning
- RNA-kvantifiering eller kartläggning
- Rengörande av plasmid-DNA
- Genomisk DNA-isolering
- Molekylviktsmarkör