Nekrotrofisk livsstil hos Rhizoctonia solani AG3-PT under interaktion med värdväxten potatis enligt transkriptomanalys

Transkriptomanalys

Den interspecifika interaktionen mellan R. solani AG3-PT isolat Ben3 med den medelresistenta potatissorten ”Arkula” analyserades på transkriptomnivå med hjälp av RNA-sekvensering. För att hitta faktorer som är viktiga för etableringen av interaktionen och den fortsatta interaktionsutvecklingen använde vi tre olika provtagningar: rent mycel av R. solani AG3-PT isolat Ben3 odlat utan att attraheras av en växande potatisplanta (Ben3); potatisgroddar vid 3 dpi av knölarna med R. solani (tidigt) och 8 dpi (sent). Vid båda provtagningstillfällena av R. solani i interaktion med potatisgrodden skördades och användes alla groddar i analysen. Nekrotiska skador på groddarna blir synliga för första gången vid 8 dpi. Därefter utfördes RNA-extraktion, RNA-sekvensering (RNAseq) och kartläggning av läsningarna till isolat Ben334:s genom för att beräkna värden för läsningar per kilobas per miljon kartlagda läsningar (RPKM). För de inokulerade proverna kartlades i allmänhet mellan 1 och 23 % av varje dataset på Ben3:s utkast till arvsmassa. För kontrollproverna kunde mellan 70 och 75 % av dessa dataset kartläggas på Ben3-genomet.

I alla tre provtagningarna kunde ett jämförbart antal gener upptäckas som uttryckta (tabell 1). I rent mycelium uttrycktes 11 206 gener av de identifierade 12 567 generna i R. solani AG3-PT-isolatets Ben3-genom, medan läsningar kunde kartläggas för 10 181 och 9 939 gener vid 3 dpi respektive 8 dpi. Sammanfattningsvis uttrycktes 11 287 gener av de identifierade 12 567 generna i R. solani AG3-PT isolat Ben3-genomet i alla transkriptom i detta experiment i något av de analyserade proverna.

Som framgår av tabell 1 skiljde sig mängderna av de totala kartlagda läsningarna avsevärt åt. Detta beror på att i Ben3-provtagningen har transkriptomet av det rena mycelet av R. solani AG3-PT-isolat Ben3 sekvenserats, medan man i de tidiga och sena provtagningarna (3 och 8 dpi) har använt en dubbel RNAseq-metod för att få tillgång till transkriptomerna hos båda de interagerande organismerna samtidigt30. Eftersom bibliotekens storlek och mängden sekvenser som producerades från varje bibliotek var jämförbara, kunde nästan alla läsningar i Ben3-provtagningen kartläggas till Ben3-isolatets genom. I de dubbla RNAseq-metoderna för provtagningarna vid 3 och 8 dpi kunde endast en bråkdel av de producerade läsningarna kartläggas till Ben3-genomet, medan de övriga huvudsakligen kartlades till potatisgenomet. På grund av dessa olika mängder av totalt kartlagda läsningar till R. solani AG3-PT-isolatets Ben3-genom per provtagning måste följande beaktas: (1) gener med lågt RPKM-värde endast i Ben3 uttrycks inte nödvändigtvis inte när svampen utmanar plantan, det kan bara bero på bibliotekens storlek, (2) gener som befinns uttryckta i alla tre provtagningar kan anses vara allmänt uttryckta, (3) gener som endast befinns uttryckta i de mycket mindre biblioteken i provtagningarna 3 och 8 dpi kan antas vara interaktionsspecifika.

De sammanfattade kartläggningsresultaten (tabell 1) visade redan att det måste finnas många gener som uttrycks gemensamt i alla tre provtagningarna. Därför konstruerades ett Venn-diagram för att jämföra de tre provtagningarna och visualisera det beräknade antalet gener som de har gemensamt jämfört med det antal gener som skiljer de enskilda provtagningarna åt (fig. 1). Mer än 9 000 gener visade sig vara uttryckta i alla tre provtagningarna, medan 871 gener uteslutande transkriberades i mycelet utan växtkontakt. Det konstaterades att 29 gener uttrycktes gemensamt i proverna 3 och 8 dpi, vilket representerar gener som endast uttrycks i närvaro av den levande potatisplantan. Dessutom var 27 gener uteslutande uttryckta vid 3 dpi, och sekvensavläsningar som kartlägger en liten uppsättning av 21 gener kunde uteslutande påvisas vid 8 dpi. Listor över dessa gener tillsammans med deras respektive RPKM-värden och beskrivningar finns i de kompletterande tabellerna 1-4.

Av de 29 gener som var vanligt uttryckta i närvaro av den levande potatisplantan kodar fyra gener för proteiner som är involverade i nedbrytning av växtens cellvägg. Detta stämmer överens med virulensstrategin hos en nekrotrof patogen med utsöndring av cellväggsnedbrytande enzymer för att inducera värdcellsnekros och läckage av näringsämnen21. Dessutom finns det en gen som kodar för ett protein som är involverat i proteinnedbrytning som ytterligare stöder denna angreppsmetod. Dessutom finns två gener som kodar för proteiner med DNA-bindande domäner och förmodad funktion i transkriptionsreglering också med i denna lista och spelar sannolikt en roll i transkriptionsregleringen av brottet (t.ex. Ben3g4553, se tabell 2). Majoriteten av de 27 gener som uteslutande uttrycks vid 3 dpi kodar för hypotetiska proteiner där ingen putativ funktion kan tilldelas. Av de 21 gener som uteslutande uttrycktes i senare skeden av interaktionen (8 dpi) kodar åtta gener för proteiner som är involverade i nedbrytning av växtcellväggar och två kodar för proteaser. Detta visar återigen den typiska strategin för en nekrotrofisk patogen.

Sammanfattningsvis visade en första undersökning av transkriptomdata från de tre provtagningarna på distinkta och rimliga skillnader, vilket visar på potentialen hos den här studien för att hitta faktorer som är viktiga för etableringen av interaktionen mellan R. solani AG3-PT isolat Ben 3 med en mottaglig potatissort och vidare utveckling av interaktionen.

De mest abundanta R. solani AG3-PT transkriptionerna i de tre provtagningarna

Den interspecifika interaktionen mellan R. solani AG3-PT isolat Ben 3 och den medelresistenta potatissorten ”Arkula” utvärderades inledningsvis genom att undersöka de mest abundanta transkriptionerna i de tre olika provtagningarna. I växande mycel som odlats i vätskekultur hittades transkriptioner av 11 206 gener från isolat Ben3-genomet. Totalt upptäcktes 698 transkript av dessa gener med medianvärden för RPKM på 100 och högre, 37 med medianvärden för RPKM på över 1000. I den tidiga interaktionsfasen (3 dpi) av knölgroddar med patogenen upptäcktes transkriptioner av 10 181 gener varav 729 uppvisade medianvärden för RPKM på 100 och högre, 25 medianvärden för RPKM större än 1 000. Ett antal 9 939 gener av R. solani AG3-PT transkriberades, varav 742 uppvisade RPKM-värden på 100 och högre, 26 RPKM-värden på mer än 1 000 vid 8 dpi (kompletterande tabeller 5-7). Sammanlagt 9 679 gener i isolat Ben3-genomet visade sig vara uttryckta i alla tre provtagningar, bland dem finns de mest förekommande transkriptionerna i var och en av de enskilda provtagningar som analyserats. Fem av dessa högst uttryckta gener (Ben3g9573, Ben3g6448, Ben3g5323, Ben3g2326 och Ben3g675) kodar för R. solani-specifika hypotetiska proteiner med okända funktioner. Dessa proteiner förväntades därför inte spela specifika roller under interaktionen med växten, utan kan snarare vara viktiga för den allmänna tillväxten och cellmetabolismen. Bland de mest frekventa transkriptionerna i varje enskild provtagning finns också flera proteiner som innehåller lektindomäner (Ben3g9146, Ben3g9350 och Ben3g8869). Ett antal sådana proteiner som innehåller en ricin-typ beta-trefolielektin-domän har också tidigare rapporterats som mest abundanta i R. solani AG1-IB-isolat 7/3/14 under interaktion med dess värdväxt sallat30. Även om de specifika rollerna för dessa proteiner med lektindomäner är obestämda har det föreslagits att R. solanis lektiner skulle kunna ha en funktion som lagringsprotein i mycelet37. Dessutom var två gener som kodar för proteiner med thuringiensis-toxindomän (Ben3g8806 och Ben3g11931) också starkt transkriberade i alla tre analyserade prover. Bacillus thuringiensis-toxiner är bakterieproteiner som är kända för sin biocidala aktivitet mot insekter38, men en rad andra organismer är också måltavlor39. Det starka uttrycket av sådana toxindomänhomologer i R. solani tyder på att dessa toxiner kan vara av allmän betydelse för R. solani AG3-PT-isolat Ben3 snarare än att spela en specifik roll i interaktionen mellan svamp och växt. En gen som kodar för ett protein för porkapsel i septum (Ben3g7115) var också bland de mest frekventa transkriptionerna i alla tre provtagningarna, vilket tyder på att den bidrar till hyfala homeostas hos basidiomycetosvampar40. Ett transkript som liknar proteinet för porhuvudet (RSOLAG1IB_6054) var också mycket rikligt förekommande i R. solani AG1-IB isolat 7/3/14 transkript som hittades i den symtomfria zonen för interaktion med sallat30. Detta protein som är specifikt för R. solani är en del av det pluggmaterial som stänger perforeringarna i hyfocellernas septalporer och förhindrar transport av cytoplasmavätskor mellan angränsande celler. Vidare var en gen som kodar för ett hemopexindomänprotein (Ben3g6614) också bland de högst uttryckta generna som var gemensamma för alla tre provtagningarna. Denna domän betecknar zinkberoende metalloproteinaser, som allmänt erkänns spela en viktig roll i den homeostatiska regleringen av den extracellulära miljön41 , men deras biologiska funktioner kan också sträcka sig bortom nedbrytning av extracellulär matris42. Eftersom alla dessa proteiner visade hög abundans i R. solani AG3-PT med och utan kontakt med värdväxten, kan de vara viktiga för den övergripande tillväxten och ämnesomsättningen men verkar inte ha någon specifik betydelse i svampens interaktion med växten.

Samspelet mellan R. solani AG3-PT och potatis

För att hitta element med relevans för att stödja interaktionen mellan R. solani AG3-PT-isolat Ben3 och potatisgrodden utfördes differentiell genuttryck som integrerats i ReadXplorer-plattformen (v2.2)43 . Denna parvisa jämförelse av transkriptom av rent mycel av isolat Ben3 med transkriptom av antingen 3 dpi eller 8 dpi av interaktion med potatisgroddar utfördes med hjälp av programmet DESeq2. Generna klassificerades som differentiellt uttryckta med ett justerat P-värde på mindre än 0,05 och en minsta vikförändring på |2| eller mer. Med hjälp av dessa kriterier kunde 592 gener tilldelas som differentiellt inducerade vid 3 dpi (summan av 242 gener som uteslutande inducerades tidigt och 350 gener som inducerades vid 3 dpi och även vid 8 dpi; tidig uppgång) medan 520 gener reducerades differentiellt vid 3 dpi (summan av 412 gener som uteslutande reducerades tidigt och 108 gener som reducerades vid 3 dpi och även vid 8 dpi; tidig nedgång). Vid 8 dpi konstaterades 688 transkript vara differentiellt inducerade (summan av 338 gener som uteslutande är sent inducerade och 350 gener som inducerats vid 8 dpi och även vid 3 dpi; sent upp) och 233 är differentiellt reducerade (summan av 125 gener som uteslutande är sent reducerade och 108 gener som är reducerade vid 8 dpi och även vid 3 dpi; sent ner). Venndiagram konstruerades för att jämföra och visualisera de differentiellt uppreglerade samt nedreglerade generna vid båda tidpunkterna under interaktionen (fig. 2). Listor över dessa gener tillsammans med deras respektive värden för vikförändring finns i de kompletterande tabellerna 8-9.

Expressionsskillnader som hittades med denna DESeq2-analys validerades i experiment med qRT-PCR. Därför måste en lämplig kontrollgen med invariant uttrycksmönster fastställas. Glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (Ben3g7151, GAPDH), ubiquitin-konjugerande enzym E2 (EUC63156, UBC), ubiquitin-proteinligas E3 (Ben3g494, UBI), förlängningsfaktor 2 (Ben3g3364, EF-2) och beta-tubulingener (Ben3g4099; TUB1) och (Ben3g5288, TUB2) testades och betatubulingenen Ben3g5288 (TUB2) visade sig vara den lämpligaste referensen i våra experiment. De relativa transkriptnivåerna för tre kandidatgener med olika uttrycksmönster normaliserades på grundval av uttrycket av denna invarianta kontroll. ΔΔCq-värden beräknades och jämfördes med respektive DESeq2-analys (tabell 2).

För alla tre kandidatgener med mycket olika uttrycksmönster överensstämde de beräknade ΔΔCq-värdena med de respektive log2-faldiga förändringsvärdena som beräknades i DESeq2-analysen, vilket visar att uttrycksskillnaderna validerades.

För alla tre kandidatgener med mycket olika uttrycksmönster utfördes dessutom GO-annotationer (Gene Ontology) för att tilldela respektive funktioner till de särskilda generna. I den fortsatta analysen lades ett särskilt fokus på signifikant inducerade gener för att företrädesvis fånga upp molekylära kandidater som kan vara viktiga för att initiera och etablera interaktionen med växten.

Differentiellt uttryckta gener (DEG) i isolat Ben3 vid 3 dpi av potatisgroddar

Differentiellt inducerade gener i isolat Ben3 i interaktion med potatisgroddar vid 3 dpi jämfört med isolatets rena mycelium valdes ut för att antas ha en funktion i att initiera och stödja interaktionsprocessen med potatisgroddarna. De särskilda genprodukternas förmodade funktioner och deras fördelning i de gemensamma GO-aspekterna för biologisk process (BP), molekylär funktion (MF) och cellulär komponent (CC) anges i figur 3.

Vid 3 dpi tilldelas differentiellt inducerade gener huvudsakligen som involverade i metaboliska processer för kolhydrater och cellulära kväveföreningar och i transport. Nästan 10 % (50 gener) av de differentiellt uppreglerade generna kodar för olika peptidasaktiviteter (t.ex. Ben3g2070, se tabell 2), medan 53 gener kodar för cellväggsnedbrytande enzymer, inklusive flera olika hydrolaser som agerar på glykosylbindningar, och pektatlyaser (t.ex. Ben3g3530, se tabell 2) eller xylanaser. För att ytterligare specificera dessa cellväggsnedbrytande enzymer annoterades alla DEG:er också enligt databasen Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (kompletterande tabell 11). Sekretion av en stor arsenal av hydrolytiska enzymer som proteaser och cellväggsnedbrytande enzymer under interaktionen44,45 krävs för att nekrotrofa växtpatogener som R. solani ska kunna framkalla cellnekros genom nedbrytning av strukturella protein- och kolhydratkomponenter i växternas cellväggar och för att orsaka läckage av näringsämnen9,30,46,47 . Hypotesen är därför att de inducerade cellväggsnedbrytande enzymerna och flera av de inducerade peptidaserna fungerar för att stödja interaktionen mellan R. solani AG3-PT och vävnaden i potatisgrodden. Sekretade peptidaser har dock också studerats ingående för sina roller som effektorer hos gramnegativa bakterier48 och även svampar47,49. Effektorer av patogener levereras vanligtvis som virulensfaktorer till värdcellerna för att undertrycka de basala försvarsreaktionerna och skapa en lämplig miljö för spridning av patogenen50,51,52. Således är den posttranslationella modifieringen av värdproteiner genom proteolytisk bearbetning en allmänt använd mekanism för att reglera växternas försvarssvar. Med det nuvarande kunskapsläget kan man anta att en eller flera av dessa inducerade proteaser har en möjlig roll som effektorer som stöder interaktionen mellan R. solani AG3-PT och potatisvärden. Det krävs dock ytterligare funktionella analyser av de enskilda proteaserna för att tydligt fastställa deras funktionella roll i interaktionen mellan patogen och värd.

En annan stor grupp bestående av 100 medlemmar av differentiellt uppreglerade gener i interaktionen vid 3 dpi beskrivs som kodande för hypotetiska proteiner. De flesta av dessa gener är specifika för R. solani och homologer kunde hittas i de andra fem annoterade genomerna R. solani AG3 Rhs1AP, R. solani AG2-2IIIB, R. solani AG8 och R. solani AG1-IA och AG1-IB. Utifrån vår differentiella genuttrycksanalys förväntas det att några av dessa gener är involverade i stödjande interaktion mellan R. solani AG3-PT och potatisgrodden. Det är redan känt att sekretoriska effektorer från svamppatogener riktar in sig på värdens immunitet med hjälp av olika strategier, t.ex. genom att hydrolysa en salicylsyreprekursor53 eller genom att binda till transkriptionsfaktorer och på så sätt hämma deras aktivitet54. Ytterligare analyser behövs för att avslöja de hittills hypotetiska proteinernas möjliga funktioner för deras olika möjliga roller i interaktionen mellan R. solani AG3-PT och potatis.

Interessant nog är den starkast differentiellt ökade genen (Ben3g6247) homolog till proteiner i LTE-familjen (lipid-translocating exporter), som RTA1 från Saccharomyces. RTA1-proteinet innehåller sju potentiella membranöverskridande segment55 och förutspås vara ett integrerat membranprotein med funktion i cellens resistens mot xenobiotika56. Andra gener i LTE-familjen kan koda för transportörer eller sensorer som underlättar utsöndringen av biosyntetiska intermediärer, antingen direkt eller indirekt56. Dessa förmodade funktioner hos LTE-familjens proteiner gör genen Ben3g6247 till en favoritkandidat som är involverad i utsöndring av komponenter som är viktiga för patogenangreppet.

Den tidiga fasen av nekrotrofisk interaktion är förknippad med celldöd hos växtvärden och produktion av olika sekundärmetaboliter och ackumulering av reaktiva syrearter21. Det har visats att antioxidativa processer och respektive genuttryck var korrelerade med nekrotiska vävnader i flera patosystem med R. solani (potatis groddar-R. solani AG3; sojabönor hypokotyl-R. solani AG4 och sojabönor blad-R. solani AG1-IA)27 . I den tidiga fasen av växelverkan mellan potatisvärden och isolat Ben3 (3 dpi) kunde inga starka bevis för induktion av antioxidativa processer i patogenhyferna observeras på transkriptionsnivå, eftersom det inte fanns någon stark ökning av glutathion S-transferas-genuttrycket eller uppreglering av andra gener som är kända för att vara inblandade i borttagning av reaktiva syrearter. Därför kan man anta att i vårt system för att kolonisera potatisgrodden med R. solani AG3-PT liknar vävnadsanalysen vid 3 dpi ett tidigt skede av växtpatogeninteraktionen, kanske före infektion av groddens vävnad. Inga synliga symptom observerades vid denna tidpunkt.

Differentiellt uttryckta gener i isolat Ben3 vid 8 dpi av potatisgroddar

För att hitta transkript som är viktiga i ett avancerat skede av interaktionen undersöktes differentiellt inducerade gener mellan rent mycel av isolat Ben3 och Ben3 som attraherats till potatisgroddar vid 8 dpi. Respektive funktionella annoteringar av genprodukterna och deras fördelning i de gemensamma GO-funktionerna visas i figur 4. Vid 8 dpi är de differentiellt inducerade generna huvudsakligen involverade i kolhydrat- och makromolekylära metaboliska processer och i transport. I detta senare skede av interaktionen kodar de uppreglerade 152 generna (> 22 %) för olika cellväggsnedbrytande enzymer (t.ex. Ben3g3530, se tabell 2). Dessutom annoterades alla DEGs också enligt databasen Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (kompletterande tabell 11). Detta ökade uttryck av gener som kodar för hydrolytiska enzymer i cellväggen visar väl den ökande patogena aktiviteten hos isolatet Ben3 samt betydelsen av nedbrytning av cellväggskomponenter för att få tillgång till näringsämnena under interaktionen, vilket bekräftar den beskrivna virulensstrategin hos en nekrotrofisk patogen21,57. Denna destruktiva taktik åtföljdes av en induktion av uttrycket av gener som kodar för integrerade komponenter i membranen. Dessa 154 mestadels okaraktäriserade integrala membranproteiner och förmodade transportörer var förmodligen involverade i upptaget av näringsämnen och nedbrytningsprodukter från hydrolasaktiviteterna. I detta skede av interaktionen tycktes den dominerande betydelsen av gener som kodar för peptidaser minska, men fortfarande var 33 gener som kodar för peptidaser differentiellt uppreglerade (t.ex. Ben3g2070, se tabell 2). Detta kan också förklaras av att hela groddar skördades, inklusive groddar med upp till 8 dagars interaktion med den utmanande patogenen och de senare framväxande groddarna med en kortare interaktionsperiod. I allmänhet är detta också representerat i de 350 gener som gemensamt var differentiellt ökade vid 3 och 8 dpi (fig. 2).

Det finns dessutom en annan stor grupp DEGs vid 8 dpi som består av 98 gener med okänd funktion. Eftersom dessa gener är Rhizoctonia-specifika utan några områden med likheter med sekvenser med tilldelade funktioner, kan man bara spekulera om deras roll för att stödja samspelet mellan patogen och växt. Ytterligare funktionella jämförelser av dessa gener och t.ex. deras differentiella uttryck i respektive patosystem kan ge indikationer på deras förmodade funktion.

I det här beskrivna experimentella systemet för att kolonisera potatisgrodden med R. solani AG3-PT-isolat Ben3 blir lesionerna synliga för första gången vid 8 dpi. Det har visats i andra experiment25,27 att nekrotrofisk interaktion och celldöd i växtvärden korrelerade med respektive genuttryck i växten och i svampen. Samsatly och medarbetare27 visade med hjälp av kvantitativ RT-PCR att uttrycket av antioxidantgener som kodar för glutation S-transferas och katalas ökade signifikant i R. solani AG3 fem dagar efter inokulering av avhuggna potatisgroddar. En sådan kraftig ökning av uttrycket av dessa antioxidativa gener kunde dock inte påvisas i de här beskrivna experimenten. Orsakerna till dessa skillnader kan bero på att man vid inokuleringen använde isolat av R. solani AG3 som uppvisar skillnader i patogenicitet. En annan skillnad är dock det faktum att Samsatly och medarbetare27 utförde experiment med fristående groddar i ett begränsat in vitro-system, medan vårt experiment fullt ut återspeglar förhållandena i in vivo-miljön med växande groddar på odlade fröknölar. Ytterligare undersökningar tillsammans med den samtidiga transkriptomanalysen i potatisvärden kommer slutligen att öka förståelsen för ett ömsesidigt förhållande i samspelet mellan värd och patogen i en miljö som liknar den naturliga situationen.

Differentiellt uttryckta gener i isolat Ben3 som jämför 3 och 8 dpi av potatisgroddar

För att särskilja mellan R. solani AG3-PT transkript som främst var relevanta vid tidig tidpunkt och de som blev viktigare vid avancerade stadier av interaktionen differentiellt uttryckta gener mellan 3 och 8 dpi av interaktionen analyserades också med DESeq2. Med hjälp av ovan nämnda kriterier med justerade P-värden på mindre än 0,05 och en minsta vikförändring på |2| eller mer kunde 173 gener tilldelas differentiellt reducerat uttryck mellan 3 och 8 dpi medan 400 gener är differentiellt ökat uttryck vid den senare tidpunkten. Kompletta listor över dessa gener tillsammans med deras respektive baseMean-värden och värden för vikförändring finns i tilläggstabell 10. Listor över de 20 mest differentiellt uttryckta generna mellan 3 och 8 dpi presenteras i tabellerna 3 och 4. Medan 10 av de 20 mest differentiellt reducerat uttryckta generna mellan 3 och 8 dpi kodar för proteiner som är involverade i proteinnedbrytning och kväveupptag och assimilering (tabell 3), är majoriteten av de gener som differentiellt ökat uttrycket mellan 3 och 8 dpi involverade i polysackaridnedbrytning med fokus på kopparberoende lytiska polysackaridmonooxygenaser för klyvning av cellulosakedjor med oxidation av olika kolväten (tabell 4).

Det är känt att kvävemetabolism och kvävereglerat genuttryck i växtpatogena svampar är av stor betydelse för etableringen av sjukdomen i värdväxten58. Nitrat är dock den mindre föredragna kvävekällan jämfört med ammonium och L-glutamin när det gäller näringsutnyttjande hos svampar, åtminstone under infektion av blad59. Hos svampar regleras detta föredragna näringsutnyttjande via repression av kvävemetaboliter och säkerställer transkriptionen av gener som kodar för aktivt permeas av ammonium och urea. Förutom det starka övergående uttrycket av gener som kodar för permeaser som transporterar ammonium och kväveföreningar (Ben3g6147, Ben3g6767, Ben3g4369 och Ben3g7775) i det tidiga interaktionsstadiet vid 3 dpi, utövade R. solani AG3-PT-isolat Ben3 också en hög induktion och ett högt uttryck av gener som är involverade i nitratupptag och assimilering (Ben3g6360, Ben3g6359 och Ben3g6361). Huruvida detta är ett särdrag hos isolat Ben3 eller en egenskap hos jordburna växtpatogena svampar behöver undersökas ytterligare.

Majoriteten av generna med differentiellt ökat uttryck mellan 3 och 8 dpi är involverade i nedbrytning av cellväggar och kodar för hydrolaser som agerar på glykosylbindningar och pektatlyaser. Detta var väntat och visar återigen på den ökande betydelsen av nedbrytning av cellväggskomponenter som bestämmer virulensstrategin hos en nekrotrof patogen21.