Mikronukleus
MN uppstår från kromosomfragment eller hela kromosomer som släpar efter anafasen under kärndelningen och som inte ingår i huvudkärnorna.13,18,19 MN är små extranukleära kroppar som uppstår i delade celler från acentriska kromosom-/kromatidfragment eller hela kromosom-/kromatidfragment som släpar efter i anafasen och som inte ingår i dotterkärnorna i telofasen.20 Vid telofasen bildas ett kärnhölje runt de eftersläpande kromosomerna och kromosomfragmenten, som sedan avvecklas och gradvis antar morfologin hos en interfaskärna, förutom att de är mindre än cellens huvudkärnor (därav uttrycket ”mikronukleus”).19 MN som bär på kromosomfragment kan vara resultatet av direkta dubbelsträngsbrott i DNA, omvandling av enkelsträngsbrott till dubbelsträngsbrott efter cellreplikation eller hämning av DNA-syntesen.20
MN kan bildas via olika vägar: nämligen från acentriska kromosom- eller kromatidfragment. En liten andel acentriska kromosomfragment kan helt enkelt uppstå från icke reparerade dubbelsträngade DNA-brott. Andra mekanismer som kan leda till MN-bildning från acentriska fragment är samtidig excisionsreparation av skadade (t.ex. 8-oxo-deoxyguanosin) eller olämpliga baser som ingår i DNA (t.ex. uracil) och som befinner sig i närheten av och på motsatta komplementära DNA-strängar.21 En annan mekanism som kan leda till MN på grund av kromosomförlust är hypometylering av cytosin i centromeriska och pericentromeriska upprepningssekvenser, t.ex. klassiska satellitupprepningar i pericentromeriska regioner och högre ordningens upprepningar av satellit-DNA i centromeriskt DNA.21 På grund av den centrala roll som kinetokoreproteiner spelar när det gäller att få kromosomerna att komma i kontakt med spindeln är det troligt att mutationer som leder till defekter i dynamiken i interaktionen mellan kinetokore och mikrotubuli skulle kunna orsaka MN-bildning till följd av kromosomförlust vid anafas. Andra variabler som sannolikt ökar MN på grund av kromosomförlust är defekter i mitotisk spindelmontering, defekter i mitosens kontrollpunkt och onormal centrosomamplifiering.21
MN:s öde efter att de bildats i den mikronukleerade cellen är dåligt känt. Deras postmitotiska öde omfattar följande: (1) eliminering av den mikronukleerade cellen som en följd av apoptos, (2) utstötning från cellen (när DNA:t inom MN inte förväntas vara funktionellt eller kapabelt till replikation på grund av avsaknaden av de nödvändiga cytoplasmakomponenterna); (3) återinkorporering i huvudkärnan (när återinkorporerade kromosomer kan vara omöjliga att skilja från dem i huvudkärnan och kan återuppta normal biologisk aktivitet), och (4) kvarhållande i cellens cytoplasma som en extranukleär enhet (när MN kan fullfölja en eller flera omgångar av DNA/kromosomreplikation).20,22
Den viktigaste fördelen med CBMN-analysen ligger i dess förmåga att upptäcka både klastogena och aneugena händelser, som leder till strukturella respektive numeriska kromosomavvikelser20 . Klastogener inducerar MN genom att bryta DNA:s dubbelhelix och bilda acentriska fragment som inte kan fästa vid spindelfibrerna och integreras i dotterkärnorna, och som därför lämnas utanför under mitosen. Samma sak sker med hela kromosomer med skadade kinetokorer; de kan inte fästa vid de mikrotubuli som drar kromatiderna mot dottercellerna under mitosen, och därför förblir de utanför de nya kärnorna. Denna skada kan genereras av kemikalier som reagerar med proteiner som bildar kinetokorerna.23,24
Aneugener är kemikalier som förhindrar bildandet av spindelapparaten under mitos. Dessa medel genererar inte bara hela kromatider som lämnas utanför kärnorna och därmed bildar MN, utan även bildandet av flerkärniga celler, där varje kärna skulle innehålla ett annat antal kromosomer. Dessa medel inducerar sannolikt också en ökning av mitotiska figurer som syns tydligt på samma objektglas. Med CBMN-analysen är det möjligt att skilja mellan MN som härrör från hela kromosomer och MN som härrör från acentriska fragment, samt att avgöra om malsegregering av kromosomer sker mellan kärnor i en binukleerad cell som kanske inte innehåller MN, genom att använda centromeriska prober.8,10,19
Pancentromeriska DNA-prober används för att skilja mellan MN som härrör från en förlust av hela kromosomer och MN som innehåller acentriska kromosomfragment. Användningen av kromosomspecifika centromeriska DNA-prober gör det möjligt att både fastställa specifika kromosomförluster som resulterar i MN och ojämlik segregering av specifika kromosomer mellan dotterkärnor även i avsaknad av MN-bildning.21 Pancentromeriska prober bör endast användas för att skilja mellan MN som har sitt ursprung i kromosomavbrott (centromer negativ) och kromosomförlust (centromer positiv). Kromosomspecifika centromersonder bör endast användas för att mäta malsegregering (på grund av nondisjunktion eller kromosomförlust) som involverar unika kromosomer.8,10,19,21,25 Utvärdering av det mekanistiska ursprunget för enskilda MN genom centromer- och kinetokoridentifiering bidrar till metodens höga sensitivitet och specificitet.20
Väsentliga faktorer påverkar MN-frekvensen i baslinjen i mänskliga lymfocyter. Ålder och kön är de viktigaste demografiska variablerna som påverkar MN-indexet; frekvenser hos kvinnor är högre än hos män med en faktor 1,2-1,6, beroende på åldersgrupp.26 MN-frekvensen var signifikant och positivt korrelerad med ålder hos män och kvinnor och påverkas av kostfaktorer som folatbrist och plasmanivåer av vitamin B12 och homocystein. Det föreslogs också att MN-indexet kan påverkas av en individs cellers benägenhet att genomgå apoptos och genetiska faktorer som genetiska polymorfismer.10,20,27
I en allmän form tillskrivs bildandet av MN en mängd olika kränkningar av det genetiska materialet, som kan klassificeras som exogena och endogena faktorer. Exogena faktorer inkluderar strålning, kemiska agenser och invasion av mikroorganismer. Endogena faktorer inkluderar genetiska defekter, patologiska förändringar, brist på viktiga näringsämnen (t.ex. folsyra) och skador inducerade av skadliga metaboliska produkter (t.ex. reaktiva syrearter).28
Hypotesen om ett prediktivt samband mellan frekvensen av MN i CBMN-analysen i lymfocyter och cancerutveckling stöds av ett antal resultat: (1) ett samband mellan MN-frekvens och cancerrisk har härletts från mekanistiska likheter med kromosomala aberrationer, som visat sig vara prediktiva för cancer; (2) in vitro observeras hög överensstämmelse mellan kromosomala aberrationer och MN; (3) en ökning av MN-frekvensen observeras i lymfocyter hos cancerpatienter och hos patienter med syndrom som gör dem cancerbenägna, t.ex. Blooms syndrom och ataxiatelangiektasi; (4) MN-frekvensen är signifikant förknippad med blodkoncentrationen av vitaminer som folat, vars brist är förknippad med ökad risk för vissa cancerformer. (5) Det finns en direkt koppling mellan MN-frekvenser och tidiga stadier av karcinogenes: Det finns nämligen ett signifikant samband mellan ökade MN-frekvenser och låggradiga och höggradiga diagnostiska kategorier av livmoderhalscancer hos kvinnor.20
Bildning av nukleära anomalier som MN, kromosomala omarrangemang och anafasbroar (vilket leder till brott-fusionsbrocykler och generering av fler MN) är händelser som ofta ses i de tidiga stadierna av karcinogenes. Förhöjda nivåer av MN tyder på defekter i DNA-reparation och kromosomsegregation som kan leda till att dotterceller bildas med förändrad gendosering eller till avreglering av genuttryck som kan leda till utveckling av den kromosominstabila fenotyp som ofta ses i cancer. Dessa överväganden ger mekanistiskt stöd för ett möjligt orsakssamband mellan MN-frekvens och cancerrisk. I en studie av Bonassi et al.29 observerades ett samband mellan MN-frekvens och cancerrisk vid icke hematologiska maligniteter, vilket tyder på att genomskadade händelser i lymfocyter kan korreleras med cancerinitierande händelser i andra vävnader via en gemensam genetisk, kost- eller miljöfaktor.