Mikrobiologi & Experiment

Isoleringen och karakteriseringen av bakteriestammar från Barrackpore kommun och Dhapa avfallsupplag genomfördes i denna studie. Bakterietillväxten beror på olika fysikalisk-kemiska förhållanden som media, pH, temperatur, inkubationstid, kolkälla osv. Därför bör man studera de olika förhållanden under vilka bakterier växer i naturliga miljöer innan man går över till massiv förökning för att använda dem som nedbrytare. Följande parametrar beaktades:

Fysiska och kemiska egenskaper hos kommunalt fast avfall

Bakterier kan växa i ett brett spektrum av fuktnivåer. I den här studien konstaterades att fukthalten i det insamlade provet från Barrackpore kommun och Dhapa soptipp var ca 65,32 % respektive 66,45 %. Bakteriepopulationen i olika jordar är nära korrelerad med deras fukthalt. Den maximala bakterietätheten återfinns i områden med ganska hög fukthalt och den optimala nivån för aeroba bakterier är ofta 50-75 % av markens fukthållande förmåga.1 Släktena Pseudomonas, Achromobacter och Bacillus förekommer i de flesta aeroba jordar; när förhållandena är anaeroba och fuktiga förekommer Clostridium. Aktinomyceter visade en liknande kvantitativ ökning under sådana förhållanden.15

I denna studie optimerades pH-värdet i de två utvalda medierna (BCDA och NA) för odling av bakteriestammar. Ph-värdet i det insamlade provet var 7,79 i båda proverna. pH är en nyckelfaktor för odling av bakterier i konstgjorda medier. Optimering av pH genomfördes i två utvalda medier nämligen Nutrient Agar (NA) och Basic czapek dox agar (BCDA). NA och BCDA vid pH 7,2 och 7,6 visade sig vara lämpliga för maximal tillväxt av bakteriestammarna. Resultaten visade att pH-värdet i provet var cirka 7,79 och att dessa stammar därför också växte bra in vitro vid pH 7-8 i BCDA och NA. Bakterier kan tolerera en jordreaktion mellan pH-nivåerna 4 och 10, men det mest gynnsamma pH-värdet för majoriteten är just en alkalisk sida till neutralitet. Bakterier som Thiobacillus thiooxidans och Acetobacter sp. kan växa vid mycket låga pH-värden mellan pH 0 och 2 och vissa Bacillus sp. kan växa vid pH 11.15 Optimal tillväxt för Thermoactinomycetes sker vid pH 8 eller 9 och är kraftigt nedsatt av reaktioner kring pH 516 Vibrio, Streptococcus faecalis och Escherichia coli tolererar också en alkalisk reaktion (pH 8-9).16

Provets NPK-halt undersöktes inledningsvis. Innehållet av organiskt material visade sig vara 27,84 % (Barrackpore kommun) och 29,32 % (Dhapa), kvävehalten i % var 0,165 (Barrackpore kommun) och 0,179 (Dhapa), fosforhalten i % var 0,502 (Barrackpore kommun) och 0,545 (Dhapa) och kaliumhalten i % var 18,29 (Barrackpore kommun) och 19,21 (Dhapa). Alla dessa analyser gav en tydlig förståelse för bakteriernas naturliga miljö och var därmed avgörande för isolering och odling av stammarna.

Bakterieisolatens kulturella egenskaper

I vår studie isolerades BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 och C3 – dessa nio bakteriestammar – i odlingsmedier. Czapek dox agar och Nutrient agar valdes ut för att avgöra vilka medier som var bäst lämpade för att säkerställa massiv tillväxt av de isolerade stammarna. czapek dox agar (BCDA) var lämplig för massiv tillväxt av BM3, D1,C2 och Nutrient agar (NA) medium var lämplig för massiv tillväxt av BM1, BM2, D2, D3, D4, C3. Det visade sig att medier som innehöll jästextrakt-xylan var lämpliga för maximal tillväxt av bakterier, men Pseudomonas sp., Bacillus spp. och Aeromonas sp. växte bra i näringsagarmiljöer. Visuell och mikroskopisk observation användes för att karakterisera de utvalda stammarna. Detaljerade uppgifter om bakteriernas koloniegenskaper finns noterade (tabell 1). Gramfärgning är en gammal och tillförlitlig metod för att observera bakterierna. Gramnegativa bakterier avfärgas med alkohol och förlorar den lila färgen från kristallviolett. Grampositiva bakterier avfärgas inte och förblir lila.

I den här undersökningen, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 och C3 – dessa nio bakteriestammar isolerades och den mikrobiologiska karakteriseringen utfördes. Resultaten visade att BM1, BM3, D1 är grampositiva baciller, BM2 är grampositiva korta baciller, D2 är grampositiva diplobaciller, D3, C2 är gramnegativa baciller, D4 är gramnegativa korta baciller och C3 är grampositiva kocker. Olika biokemiska tester utfördes också på de nio isolaten för att känna till deras biokemiska egenskaper. Uppgifter om bakteriernas biokemiska egenskaper finns i tabell 2.

Ovanstående resultat gav en uppfattning om de isolerade stammarnas morfologi, koloniegenskaper och biokemiska karaktär, vilket skulle underlätta identifiering och karakterisering av de isolerade bakteriestammarna i framtiden.

Optimering av tillväxtförhållanden

I denna undersökning observerades tillväxten av isolerade stammar i olika tillväxtmedier som NA, ACDA och BCDA. Man såg att basic czapek dox agar (BCDA) var lämplig för massiv tillväxt av BM3, D1, C2 och nutrient agar (NA) medium var lämplig för massiv tillväxt av BM1, BM2, D2, D3, D4, C3.

I detta experiment inkuberades bakteriekulturerna av 9 stammar vid olika temperaturer som 25, 29, 34, 37 och 40 °C. Den optimala tillväxten för alla stammar konstaterades vid 37 °C. Det optimala temperaturintervallet för bakterier är från cirka 25-36 °C. Ett stort antal bakterier kan växa ganska bra vid en temperatur på 10-4 °C.6 Sultana17 observerade att en temperatur på 33±4 °C var idealisk för bakterietillväxt.17 Vissa bakterier utvecklas kraftigast vid temperaturer under 20 °C. Termofila bakterier växer bra vid temperaturer 45-65 °C och vissa termofila bakterier kan inte föröka sig under 40 °C.1

De stammar som erhölls i den här studien inkuberades under olika inkubationsperioder (6, 12, 24, 36, 48 och 72 timmar). En inkubationstid på 24 timmar var lämplig för BM1, BM2, D2, D3, D4 och C3, medan BM3, D1 och C2 visade sig vara lämpliga med en inkubationstid på 36 timmar. Coliforma bakterier växer under en inkubationstid på 24±2 timmar och vid 32 °C, och de uppvisar god tillväxt vid 37 °C under 48 timmars inkubation. Vid visuell observation konstaterades att efter 24 timmars inkubation var färgen på BM2 ljusorange, BM1 var vit och BM3 var gräddvit i det medium de föredrog (BCDA och NA). Efter 48-72 timmars inkubation var färgen på BM2 orange, BM1, D1 var gula, C2 var röd och BM3, D2, D3, D4, C3 förblev gräddvita. Kolonityperna av stammarna BM1, BM2, D2 och D4 var våta och resten var gräddiga. Stafylokocker och mikrokocker producerar gyllenbruna, gula eller vita kolonier på vanliga medier. Vissa Enterokocker, Coryneformer och Enterobakterier kan producera svarta kolonier på vanliga medier.8

Antagonism assay

Cross streaking method användes för att bestämma antagonismen mellan bakteriestammarna för deras framtida användning i olika aspekter. Detaljer om antagonismen inom bakterieisolaten beskrivs (tabell 3).

BM2 har antagonism med alla andra stammar så det är inte möjligt att utveckla ett konsortium med denna stam som ett av isolaten. D1, D3 har också antagonism med de flesta andra stammar. BM1 är den mest potenta stammen eftersom den inte har antagonism med något av de andra isolaten. BM3, D2, D4, D5 och D6 har antagonism med ett fåtal isolat och dessa stammar kan tillsammans med BM1 testas i olika kombinationer för att förbereda ett konsortium.

Toleransanalys av tungmetaller

Fem tungmetaller (As, Zn, Pb, Hg, Cd) valdes ut för att bestämma de isolerade bakteriestammarnas förmåga att tolerera metaller (BM1, BM2, BM3, DF1, D2, D3, D4, C2, C3). Toleranstestet visade att bland de fem tungmetaller som undersöktes uppvisades maximal tolerans för Pb, där mikroorganismerna växte upp till 4 000 ppm, och minimal tolerans för Cd, där mikroorganismerna inte växte över 30 ppm. MIC noterades när isolaten inte växte på plattorna ens efter 10 dagars inkubation. Resultatet visar att för alla de tre bakterierna varierade MIC från 250 till 350 ppm för As, Cd (10-30 ppm), Zn (200-300 ppm), Hg (200-300 ppm) och Pb (3000-4000 ppm) (tabell 4). I den aktuella studien fann man den högsta toleransen för As och Cd i BM1, medan den högsta Zn-toleransen observerades i BM2 och BM3 uppvisade den högsta ackumuleringen av Hg och Pb. I vår studie är den mest toxiska metallen (med lägst MIC) Cd medan den minst toxiska metallen som testades är Pb (tabell 4).

MIC noterades när isolaten inte växte på plattorna ens efter 10 dagars inkubation.18 Mergeay et al.19 testade de minimala hämmande koncentrationerna (MIC) av flera olika metaller och fann att den mest toxiska metallen (med lägst MIC) var kvicksilver medan den minst toxiska metallen var mangan.19 Den mikrobiella toleransen vid varje koncentration av tungmetall skildrades med hjälp av cup assay-testet. Diametern på den hämmande zonen runt varje kopp ökade med ökningen av koncentrationen av tungmetaller, vilket tyder på att tungmetallerna har en toxisk effekt på mikroorganismernas tillväxt. Barrackpore kommun och Dhapa avfallsupplag samlar in allt fast hushålls- och industriavfall från Barrackpore stad, Kolkata stad respektive dess omgivningar. Avfallet från hushåll och industri är en lämplig miljö där mikroorganismerna kan utveckla motståndskraft mot tungmetaller. Förekomsten av små mängder tungmetaller i det fasta avfallet kan leda till att tungmetallresistenta mikroorganismer uppstår. Den mikrobiella resistensen mot tungmetaller tillskrivs en rad olika avgiftningsmekanismer som utvecklats av resistenta mikroorganismer, t.ex. komplexering genom exopolysackarider, bindning till bakteriella cellhöljen, metallreduktion, metallutflöde osv. Dessa mekanismer kodas ibland i plasmidgener som underlättar överföringen av resistens mot giftiga metaller från en cell till en annan.20 Den tungmetallresistenta organismen skulle kunna vara ett potentiellt medel för biologisk sanering av tungmetallföroreningar. Eftersom tungmetaller alla är likartade i sin toxiska mekanism är flera metalltoleranser vanliga fenomen bland tungmetallresistenta bakterier.21

Antibiotikakänslighetsanalys

Antibiotikakänslighetstest hjälper till att bestämma hur effektivt ett antibiotikum är mot testorganismen. De nio isolaten undersöktes för sin känslighet mot fyra antibiotika och resultatet noterades (tabell 5). Antimikrobiella föreningar produceras av de flesta isolaten som kan tjäna den medicinska vetenskapen. D1, D3 och D5 visade ingen antimikrobiell aktivitet.

Antimikrobiell aktivitet

Produktion av antimikrobiella föreningar verkar vara ett allmänt fenomen för de flesta bakterier. I den aktuella studien visade 3 isolat antibakteriell aktivitet och 5 isolat svampdödande aktivitet, men 3 isolat visade varken antibakteriell eller svampdödande aktivitet mot patogenerna. Resultatet har redovisats (tabell 6). En liknande studie rapporterades av Subramaniam et al.22 En mängd antimikrobiella föreningar produceras av medlemmar av släktet Bacillus, varav många identifieras som peptider, lipopeptider och fenolderivat. Sökandet efter nya sekundära metaboliter med olika biologisk aktivitet i olika miljöer har fått större uppmärksamhet under de senaste åren.

Extracellulär enzymproduktion

Med den växande medvetenheten om miljöskydd har användningen av enzymer, särskilt från extremofiler, fått stor uppmärksamhet i många industriella processer. Under de senaste åren har mikrobiella enzymer ersatt kemiska katalysatorer vid tillverkning av kemikalier, textilier, läkemedel, papper och jordbrukskemikalier för livsmedel. Enzymbaserade industriella bioprocesser konkurrerar nu direkt med etablerade kemikaliebaserade processer. I den här studien har dock de nio isolaten genomgått en kvalitativ analys för produktion av åtta olika enzymer, t.ex. proteas, lecitinas, DNas, lipas, cellulas, amylas, katalas och oxidas. En liknande studie rapporterades av Subramani och Narayanasamy.23 Intressant nog visade 6 av dem i vår studie produktion av proteasenzym som har ett högt marknadsvärde. Alla de nio stammarna producerade katalas och oxidasenzym. Resultatet noteras (tabell 7).

Proteasanalys

6 stammar (BM1, BM3, D1, D3, C2 och C3) av de nio isolaten uppvisade proteasproduktion. Proteas har en bred tillämpning inom livsmedelsindustrin, tvättmedelsindustrin, läkemedelsindustrin och vid nedbrytning av fast avfall, och därför utfördes en kvantitativ analys av det producerade proteaset. Aktiviteten hos det producerade proteasenzymet bestämdes och resultatet uttrycktes i IU/ml. Resultatet visas i tabell 8. Den kvantitativa analysen av proteas visade att bland de sex stammarna producerar BM1 proteas med ett högt titervärde och Gupta et al.,24 rapporterade på liknande sätt alkalisk proteasproduktion från bakteriearter och dess industriella tillämpning.

Avfallsnedbrytningspotential hos isolerade bakterier

Proteasenzym har stor betydelse för nedbrytning av avfall. De sex stammar som kan producera proteasenzym utsattes därför för ett test av effektiviteten i nedbrytningen av avfall. I vår studie kan man konstatera att BM1 har den högsta nedbrytningspotentialen följt av BM3. BM1 är också en stark producent av proteasenzym och har därför också en bättre nedbrytningsförmåga (figur 1). När avfallet bryts ner av mikroorganismer (bakterier) minskar ströets vikt. I den aktuella studien av nedbrytningen observerade vi att vikten av det behandlade avfallet minskade eftersom bakterierna bröt ner det och omvandlade det till enkla molekyler. Den procentuella viktförlusten för avfallsproverna ökade i takt med att nedbrytningsprocessen fortskred, vilket framgår av figur 1. Liknande observationer rapporterades av Zaved et al,25 om studier av viktförlust av sopor med hjälp av specifika bakterier i Bangladesh. I vår studie kan man observera att BM1 har den högsta nedbrytningspotentialen följt av. BM1 kan således användas effektivt för biologisk sanering av fast avfall.