Kryptokromen

Cirkadiska biologiska klockor är biokemiska oscillatorer som cyklar ungefär var 24:e timme och som kan återställas genom exponering för ljus och andra miljösignaler. Hos djur finns det en central oscillator i hjärnan som styr hela organismens cirkadiska beteende samt perifera oscillatorer i vissa vävnader. Oscillationen uppstår genom en transkriptionell återkopplingsslinga som involverar en uppsättning klocktranskriptionsfaktorer, inklusive timeless (Tim), period (Per), clock (Clk) och Bmal1 samt kryptokromer. Kryptokromer uttrycks allestädes närvarande i alla organismers organ och vävnader, och de är i allmänhet kärnproteiner som reglerar genuttryck. De bäst studerade djurkryptokromen är Drosophilas kryptokrom Cry och musens kryptokromer Cry1 och Cry2 , och de två Arabidopsis-kryptokromen CRY1 och CRY2 har också studerats ingående.

Drosophilakryptokromer

Drosophila Cry är ett huvudsakligen nukleärt protein som medierar reglering av den cirkadiska klockan med hjälp av ljus, även om det också kan hittas i cytosolen . Det reglerar den cirkadiska klockan genom att interagera direkt med proteinet Tim för att undertrycka klockans negativa återkopplingsslinga (figur 3a). Ljus stimulerar Cry-Tim-interaktionen, vilket främjar ubiquitinering och proteosomberoende nedbrytning av Tim och undertrycker bildandet av heterodimern Per-Tim. Inhiberingen av en heterodimer av Clock- och Cycle-proteinerna genom Per-Tim-heterodimern släpper därmed och den cirkadiska oscillationens fas återställs (figur 3a). Kryptokrom är dock uppenbarligen inte den enda fotoreceptorn som drar igång den cirkadiska klockan i Drosophila. Beteende rytmiken hos den crybmutanta flugan, som saknar Cry-funktionen, kan ändå dras in som svar på ljus om inte signaltransduktionen från synpigmentet också elimineras . Förutom sin roll som fotoreceptor för inryckning av den centrala oscillatorn i Drosophila har Cry också en ljusoberoende roll i funktionen av den perifera cirkadiska oscillatorn .

Däggdjurens kryptokromer

De två funktionerna hos Drosophila Cry – som fotoreceptor för medryckning av den cirkadiska klockan tillsammans med visuella pigment och som en integrerad komponent i proteinkomplexet för den cirkadiska oscillatorn – är också kännetecknande för däggdjurens kryptokromer. Däggdjurens kryptokromer är huvudsakligen nukleära proteiner , men de kan också finnas i cytosolen . Liksom Drosophila Cry har däggdjurens kryptokromer både ljusberoende och ljusoberoende funktioner i regleringen av den cirkadiska klockan. Flera observationer visar att däggdjurens Cry-proteiner har en ljusberoende roll. Knockoutmöss som saknar en eller båda Cry-generna har en minskad eller avskaffad förmåga att inducera uttryck av gener som per och protoonkogenen c-fos som svar på ljus . Dessutom har pupillerna hos muterade möss som saknar både Cry1 och Cry2 reducerade reflexreaktioner på ljus .

Å andra sidan uppvisar den dubbelt muterade Cry1 Cry2-musen en till synes normal rytmicitet i ljus-mörker-cykelförhållanden, men den förlorar rytmiciteten ögonblickligen och helt och hållet i fritt löpande (alltid mörka) förhållanden . Dessa observationer tyder på att Cry-proteinerna har en viktig och ljusoberoende funktion i däggdjurens centrala cirkadiska oscillator och att kryptokromerna inte är de enda fotoreceptorerna som förmedlar ljusstyrning av klockan. Det faktum att kryptokromer är integrerade delar av musens centrala oscillator gör det nästan omöjligt att direkt testa deras roll i ljusstyrningen av klockan. Trots detta har man funnit att, något analogt med situationen för Drosophila, musens cry-mutant behåller sin förmåga att förmedla ljusinsläpp om inte funktionen hos synpigmenten samtidigt störs. Trippelmuterade möss som bär på mutationer i båda kryptokromerna tillsammans med en retinal degenerativ mutation är nästan arytmiska under ljus-mörker-cykelförhållanden . Dessa resultat visar att Cry-proteiner från däggdjur verkligen är involverade i regleringen av den cirkadiska klockan genom ljus, men att deras roll i ljusstyrningen av den cirkadiska klockan utförs redundant av andra fotoreceptorer. Det verkar nu klart att de ytterligare fotoreceptorer som agerar tillsammans med kryptokromer för att driva in däggdjurens cirkadiska oscillator är visuella stavkottopsins och det besläktade proteinet melanopsin .

Likt Cry från Drosophila interagerar däggdjurens kryptokromer fysiskt med klockaproteiner, inklusive de promotorbindande transkriptionsregulatorerna Per, Clk och Bmal1 (figur 3b). Till skillnad från Drosophila Cry är däggdjurs Cry-proteiner komponenter i den cirkadiska klockans negativa återkopplingsslinga (figur 3b). Kryptokromets fysiska interaktion med andra klockkomponenter påverkar deras aktivitet, interaktion, nedbrytning eller nukleära trafikering och ändrar följaktligen transkriptionsregleringen av klockgenerna . Men interaktionen mellan kryptokromer och andra klockaproteiner som Per, Clk och Bmal1 verkar inte påverkas av ljus, vilket tyder på att sådana interaktioner kanske inte är mekanismen för fotostyrning av den cirkadiska klockan, vilket de är i Drosophila. Förutom den direkta regleringen av transkription via fysisk interaktion med promotorbindande transkriptionsregulatorer kan kryptokromer också påverka den cirkadiska klockan genom att delta i regleringen av histonmodifieringar , men hur detta fungerar återstår att klarlägga.

Arabidopsiskryptokromer

Arabidopsis CRY1 och CRY2 är övervägande nukleära proteiner som förmedlar reglering av genuttryck och medling av den cirkadiska klockan som svar på ljus . CRY1 och CRY2 spelar viktiga roller i växternas fotomorfogenes, t.ex. hämning av stamförlängning av blått ljus, stimulering av bladutbredning av blått ljus och reglering av blominitiering av dagslängden . Det verkar som om kryptokromer styr utvecklingsförändringar hos växter via förändringar av genuttrycket som svar på ljus. CRY1 och CRY2 är tillsammans ansvariga för blåljusberoende förändringar i genuttrycket av upp till 10-20% av Arabidopsisgenomet .

Det finns minst två mekanismer genom vilka kryptokromer kan påverka nukleära genuttrycksförändringar som svar på ljus. För det första kan en kryptokrommolekyl interagera med proteiner som är associerade med transkriptionsmaskineriet för att påverka transkriptionen direkt. Arabidopsis CRY2 binder till kromatin på ett DNA-sekvensoberoende sätt ( och M. Maymon och C.L., opublicerade observationer), men det är oklart hur ett sekvensoberoende kromatininteragerande protein kan reglera genuttryck. Till skillnad från djurens kryptokromer som har visat sig reglera transkriptionen via fysiska interaktioner med promotorbindande transkriptionsregulatorer har ingen sådan interaktion rapporterats för växternas kryptokromer. En alternativ modell är att växternas kryptokromer kan interagera med proteiner som utövar andra cellulära funktioner för att reglera stabiliteten, modifieringen och den cellulära trafiken av transkriptionsregulatorerna. Växtkryptokromer har till exempel visat sig interagera med ett E3 ubiquitinligas, COP1, vilket tyder på att växtkryptokromer kan verka på ett sätt som ännu inte upptäckts för djurkryptokromer . I överensstämmelse med detta synsätt har man nyligen också funnit att Arabidopsis kryptokromer medverkar till att blått ljus undertrycker den proteasomberoende nedbrytningen av en viktig blomreglerare, CONSTANS, med hjälp av blått ljus. Exakt hur kryptokromer gör detta måste undersökas ytterligare.

Mekanism

Kryptokromernas katalytiska mekanism har inte klarlagts till fullo, men vissa ledtrådar kan hittas i mekanismen för CPD-fotolyaser, där FAD spelar den huvudsakliga katalytiska rollen . I en DNA-reparationsreaktion binder CPD-fotolyas till DNA:s pyrimidindimer och ”vänder” den ut ur DNA-duplexen och in i enzymets FAD-tillgångshålighet för att bilda ett stabilt komplex. Den andra kromoforen (pterin eller deazaflavin), som också kallas ”antennkromoforen”, absorberar fotoner av blått ljus eller UV-A-ljus och överför excitationsenergin till FAD:s flavin. Flavin i det exciterade tillståndet donerar en elektron till pyrimidindimeren för att klyva cyklobutanringen. Elektronen överförs tillbaka till flavin i denna process, vilket resulterar i regenerering av flavin i grundtillstånd. Den reparerade dinukleotiden passar inte längre in i FAD-tillträdeshålan, så den dissocieras från fotolyaset. Den exakta rollen för FAD och FAD-åtkomsthålan i kryptokromernas funktion är fortfarande oklar, men det är tänkbart att den också kan vara involverad i elektronöverföringsreaktioner.

Men även om PHR-regionen, som innehåller kromoforen eller kromoforerna, är den mest konserverade delen av proteinerna, har den karboxyterminala domänen visat sig spela en roll i funktionen eller regleringen av både djur- och växtkryptokromer. Uttryck av de karboxyterminala domänerna av Arabidopsis kryptokromer som är fusionerade med markörenzymet b-glukuronidas ger ett konstitutivt tillväxtsvar på ljus även i mörker i avsaknad av PHR-regionen . Däremot är PHR-regionerna i Drosophila och Xenopus kryptokromer fysiologiskt aktiva i avsaknad av den karboxyterminala domänen . Den karboxyterminala domänen hos Drosophila Cry är viktig för proteinets stabilitet, interaktion med Tim och fotoreceptorns känslighet för cirkadiska ljussignaler , medan den karboxyterminala domänen hos Xenopus Cry krävs för dess nukleära lokalisering .

Kryptokromer regleras genom fosforylering. Det har visats att Arabidopsis kryptokromer fosforyleras som svar på blått ljus och att detta är förknippat med fotoreceptorernas funktion och reglering . När Arabidopsis CRY1 uttrycktes i insektsceller visade det sig dessutom genomgå ATP-beroende och blåljusberoende autofosforylering . Det är inte känt om djurens kryptokromer också binder till ATP, även om det har visats att musens kryptokromer är fosforylerade .

Samspelet mellan Arabidopsis CRY1 PHR-regionen och ATP har några intressanta egenskaper som påminner om samspelet mellan pyrimidindimer och fotolyas: ATP:s fosfatgrupper är exponerade för lösningsmedel, adenin- och ribosegrupperna är djupt nedgrävda i FAD-tillträdeshålan, och ATP kan ha en vattenmedierad kontakt med FAD . Interaktionen mellan Arabidopsis CRY1 pHR-regionen och ATP saknar också flera egenskaper som vanligen återfinns i protein-ATP-interaktioner, t.ex. protein-fosfatinteraktion, protein-Mg2+-kontakt och en närliggande serinrest för fosfotransfer . En undersökning av topologin i CRY1 PHR-regionens struktur visar dock att alla dessa egenskaper potentiellt skulle kunna tillhandahållas av den karboxyterminala domänen hos kryptokromet (figur 4). Observationen att de serinrika karboxyterminala domänerna hos Arabidopsis-kryptokromer som fusionerats med β-glukuronidas är konstitutivt fosforylerade in vivo (, tyder på att en fosfotransfer kan ske från ATP som är bundet till FAD-tillträdeshålan till den närliggande karboxyterminala domänen (figur 4a). Det är också tänkbart att FAD som exciteras av fotoner kan utlösa elektronöverföring till nukleoiden och fosfotransfer från ATP till serinrester på den karboxyterminala domänen. Eftersom PHR-regionens yta är övervägande negativt laddad, särskilt på den plats där den karboxyterminala domänen sannolikt kommer att interagera med den, skulle den fosforylerade karboxyterminala domänen då stötas bort från PHR-regionens yta, vilket resulterar i en förändring av kryptokromets konformation. Denna konformationsförändring skulle göra det möjligt för den att interagera med andra signalproteiner och sprida ljussignalen (figur 4a). Alternativt kan en annan kryptokrommolekyl som binder sig till FAD-tillträdeshålan också ge de saknade egenskaperna som behövs för en produktiv ATP-kryptokrominteraktion. Faktum är att både CRY2-CRY2-interaktion och CRY1-CRY2-interaktion kan upptäckas i Arabidopsis (D. Shalitin, X. Yu och C.L., opublicerade observationer). Bildandet av antingen en homo-oligomer eller en hetero-oligomer av kryptokromer skulle ge en mekanism för intermolekylär fosforöverföring, vilket kan förändra strukturen hos kryptokromerna (figur 4b, c).