RECEPTOR
Erytropoietinreceptorn har klonats med hjälp av en expressionsstrategi från ett cDNA-bibliotek från murina erytroleukemiska celler (D’Andrea et al., 1989). Den mänskliga erytropoietinreceptorgenen är lokaliserad på kromosom 19p (Winkelman et al., 1990). Det finns åtta exoner och sju introner som kodar för en 507 aminosyrapeptid med en molekylvikt på 66 kDa. I den mänskliga genen kodar exon 1-5 för den extracellulära domänen med 251 aminosyror, exon 6 för en membranöverskridande a-helikal region med 20 aminosyror och exon 7-8 för den cytoplasmatiska domänen med 236 aminosyror (Youssoufian et al., 1993). Den mänskliga erytropoietinreceptorn har inga N-länkade glykosyleringsställen, men en hög frekvens av serin- och threoninrester (Jones et al., 1990). Det finns 82 % identitet mellan humant och murint erytropoietin. Korsbindning av erytropoietin till cellytan hos erytroida celler har avslöjat två accessoriska molekyler på 85 och 100 kDa som inte känns igen av anti-p66-antikroppar (D’Andrea och Zon, 1990; Mayeux et al., 1991). Deras funktion måste dock bestämmas.
Erytropoietinreceptorn tillhör typ 1-familjen av cytokinreceptorer med enkeltransmembran. Denna familj delar en bevarad extracellulär domän som består av fibronectin typ III (FNIII) subdomäner, samt ett bevarat α-kedjans cytoplasmatiska box 1-motiv som binder selektivt till Janus kinaser (JAK) (Bazan, 1990b). Den extracellulära regionen av erytropoietinreceptorn innehåller två FNIII-subdomäner (D1 och D2), som bildar en L-form, med den långa axeln av varje domän i linje med ungefär 90° till den andra axeln. Den NH2-terminala D1-domänen består av fyra på fyra a-strängar och D2-domänen av sju aniparallella a-strängar (Livnah et al., 1996). D1-domänen bildar ett h-typveck med en hybrid FNIII/immunoglobinliknande topologi, och två distala par cysteinrester bildar disulfidbryggor. Den membranproximala D2-domänen veckar sig med standard FNIII-topologi av s-typ och innehåller ett konserverat WSXWS-motiv (dvs. tryptofan-serin-någon aminosyra-tryptofan-serin), som är viktigt för erytropoietinreceptorns veckning (Quelle et al., 1992). D1- och D2-domänerna bidrar tillsammans med sex slingor för erytropoietininteraktioner. Den cytoplasmatiska regionen som är rik på aminosyrorna prolin, glutamin och aspartas innehåller en box 1-domän (rester 257-264) som är specifik för JAK2 (Zhuang et al., 1994; Jiang et al, 1996), en box 2-domän (rester 303-313) och åtta fosfotyrosinplatser (Tyr 343, 401, 429, 431, 443, 460, 464, 479) som förmedlar rekryteringen av effektorer som kodar för Src homology-2 (SH2)-domänen. En förlängd box2 (rest 329-372) är nödvändig för att binda tyrosinkinasreceptorn KIT efter aktivering av dess ligand och orsakar tyrosinfosforylering av erytropoietinreceptorn, vilket tyder på en funktionell interaktion mellan de båda receptorerna (Wu et al., 1995a). Erytropoietin aktiverar erytropoietinreceptorn genom dimerisering (Philo et al., 1996). Den ena p66-molekylen binder erytropoietin med hög affinitet (Kd cirka 1 nM), den andra med lägre affinitet (Kd cirka 2 μM). Med hjälp av mutationer och deletioner har erytropoietins aktiva platser kartlagts (Boissel et al., 1993; Wen et al., 1994; Elliott et al., 1997). Bivalenta, men inte monovalenta monoklonala antikroppar riktade mot den extracellulära domänen av erytropoietinreceptorn inducerar proliferation av erytropoietinberoende cellinjer och bildning av BFU-E, vilket tyder på en receptoraktivering genom dess dimerisering (Elliot et al., 1996). Samma effekt kan uppnås med hjälp av små erytropoietinmimetiska peptider (EMP) (Livnah et al., 1996; Wrighton et al., 1996). Även om EMP inte har någon sekvenshomologi med erytropoietin binder de specifikt till erytropoietinreceptorn. Punktmutationer i den extracellulära domänen (R129C, E132C eller E133C) bildar disulfidbindningar och aktiverar konstitutivt även receptorn (Watowich et al., 1994). Särskilt mutationen av arginin 129-resistensen till en cystein är onkogen och inducerar erytroleukemi (Longmore och Lodish, 1991). EMP33 kan däremot dimerisera, men inte aktivera receptorn, vilket tyder på att konformationsförändringen i den dimeriserade receptorn spelar en viktig roll för signalgivningen (Livnah et al., 1998; Remy et al., 1999). Det har föreslagits att det finns preformade inaktiva receptordimerer på cellytan, som förmedlas av de mellanliggande D1-D2-regionerna och som ger en separation på 79 A vid basen av deras extracellulära domäner (Livnah et al., 1996). Efter att ha bundit en agonist ändrar de extracellulära receptordomänerna sin struktur i en definierad orientering med ett avstånd på 39 Å vilket ger en justering av deras cytoplasmatiska komponenter och leder till signalering (Wilson och Jolliffe, 1999).
Bortsett från att binda erytropoietin kan erytropoietinreceptorn aktiveras genom andra mekanismer. Det gp55-höljeprotein som kodas av det murina Friend-viruset inducerar erytroleukemi hos möss efter att ha bundit till och aktiverat den murina erytropoietinreceptorn (Wolff och Ruscetti, 1985; Li et al., 1990). Dessutom kan syntetiska peptider som inte har någon sekvenshomologi med erytropoietin stimulera erytropoietinreceptorn (se nedan).