Klinisk, genetisk och strukturell grund för uppenbart mineralokortikoidöverskott på grund av brist på 11β-hydroxysteroiddehydrogenas typ 2

Resultat

Vi rapporterar demografi och klinisk fenotyp hos 36 genetiskt bekräftade AME-patienter från det internationella konsortiet för sällsynta steroidstörningar. Majoriteten av patienterna var av omansk (22 av 36) och persisk (6 av 36) härstamning, varav 75 % kom från konsanguina äktenskap, huvudsakligen inom Oman (fig. 1B och tabell S1). Medianåldern vid AME-diagnosen var 4,6 år (intervall: 0,1-15) och kohorten var jämnt fördelad för båda könen. Majoriteten av patienterna (86 %) föddes till terminen och 76 % föddes små för gestationsåldern. Fig. 1A visar att det i vår kohort fanns sex missade, en insättning, två deletioner, tre ramförskjutningsmutationer och två indels. Det förväntade patofysiologin för AME var det presenterade genomsnittliga arteriella trycket förhöjt över den 90:e percentilen för alla försökspersoner (fig. 1C). Den genomsnittliga serumkaliumnivån vid diagnosen var låg på 2,72 mmol/L (intervall: 1,5-4,1 mmol/L), medan serumbikarbonaten var hög på 29,5 mmol/L (intervall: 20-38 mmol/L) (fig. 1 D och E). Serumaldosteronnivåerna var förväntat låga (fig. 1F), med två patienter med förhöjda nivåer av oklara skäl. Dessutom var reninnivåerna låga, med undantag för två patienter (10,4 och 14 ng/mL/h) som stod under behandling (tabell S1). I en undergrupp av 29 patienter var den genomsnittliga kvoten (THF + alloTHF)/THE, som representerar de viktigaste urinmetaboliterna av kortisol och kortison, signifikant förhöjd vid 19 (intervall: 3-55, normal: 1,0) (fig. 1G). Noterbart är att 27 av 36 (75 %) patienter också uppvisade nefrokalcinos. Nefrokalcinosen kan uppstå på grund av kronisk långvarig hypokalemi som noterats till exempel vid Bartters syndrom typ III (14).

För att förstå om den kliniska fenotypen av HSD11B2-brist skulle kunna förutsägas genom att undersöka förändringar i enzymstrukturen som induceras av en given HSD11B2-mutation, utförde vi in silico-analyser med hjälp av tre östrogena HSD17B1 som uppvisade 27 % sekvenslikhet med HSD11B2 över 284 aminosyror (Fig. S1A). Den humana HSD11B2-modellen uppvisade ett karakteristiskt konserverat NAD-bindande Rossmann-veckmotiv (Fig. S1B) med en intilliggande substratbindande plats (Fig. S1 C och D). MD-simuleringarna på 500 ns av de monomera och dimeriska formerna av HSD11B2 visade på en stabil modell med stabilt veckat protein (Fig. S1 E-H). Vi använde programvaran Internal Coordinate Modeling (ICM) (www.molsoft.com) (18) för att bestämma ΔΔG för missense-mutationer som hittats hos AME-patienter eller experimentellt konstruerade mutationer. Alla mutationer (fig. 2A) visade en ökning av ΔΔG-värdena, vilket tyder på förlust av proteinets stabilitet och funktion (fig. 2B).

HSD11B2 existerar som en homodimer i sitt inaktiva tillstånd (13). Fyra rester – nämligen R186, E190, A237 och R336 – ligger vid dimergränssnittet och skulle därför kunna störa dimerbildningen (fig. 2C). Resterna R186 och E190 är placerade vid dimergränssnittet på α4-helixen. En intersubunit jonparinteraktion (R186-E190) bildas som ett resultat av den tvåfaldigt inverterade symmetrin hos den intilliggande subenheten (Fig. 2D), som liknar jonparet R112-E120 i HSD17B1 (15⇓-17). Viktigt är att denna interaktion visade sig vara stabil och bibehölls under hela loppet av 500-ns MD-simuleringar (fig. 2 E-G). Vidare visade sig interaktionen stabilisera α4-helixen och bibehåller flexibiliteten runt den koenzymbindande platsen. Således resulterar R186C-mutationen i en förlust av jonparet mellan enheterna och skjuter jämvikten mot bildandet av ett aktivt monomeriskt enzym (fig. 2H). Den förhindrar också bildandet av den intrahelikala jonparinteraktionen och tillåter därmed destabilisering av strukturella element runt den koenzymbindande platsen.

Det finns flera andra störande mutationer vid detta dimergränssnitt som involverar resterna A237, D244, L251 och D176. Resterna A237 är omgivna av L241 och V239 från båda HSD11B2-subenheterna. Dess mutation till Val ökar hydrofobiciteten hos detta kluster och stärker enzymets inaktiva dimertillstånd (fig. 2I). Resterna D244 skapar inte bara en saltbrygga inom enheten med R336 som håller ihop α5-helixen och β7-bladen, utan även vätebindningsinteraktioner med R360 från den intilliggande underenheten (fig. 2J). Dess mutation till Asn minskar styrkan i R360-interaktionen, vilket leder till att saltbryggan med R366 försvinner; detta försämrar i sin tur proteinets stabilitet. På samma sätt ökar mutationen av en hydrofob sidokedja från L251 till en hydroxylgrupp från Ser polariteten och bildar en vätebindning med de positivt laddade sidokedjegrupperna från R361; detta förbättrar dimerbindningen (fig. 2K). Slutligen skapar mutationen av D176 till Asn en vätebindning mellan asparagin och T200, vilket förstärker det inaktiva dimertillståndet (fig. 2L).

Mutationer av HSD11B2-rester som bildar substrat- eller koenzym (NAD+)-bindningsfickan har i in vitro-studier visat sig eliminera enzymaktiviteten (19) och orsaka svår AME. Till exempel är Y226 belägen i den substratbindande fickan (fig. 3A). Den aromatiska fenolsidokedjan bildar hydrofoba interaktioner med substratets aromatiska ring. Mutationen Y226N ersätter denna rest med en icke-aromatisk rest, vilket resulterar i förlust av hydrofobisk stapling, vilket stör substratbindningen (fig. 3A). Dessutom ändrar denna mutation sidokedjan från att vara hydrofob till hydrofil, vilket är ogynnsamt för bindning av ett hydrofobt substrat. Mutationen A221V ersätter den korta sidokedjan med en något mer skrymmande sidokedja av Val, vilket stör substratbindningen genom att minska volymen i fickan, medan mutationen A221G minskar hydrofobiciteten och introducerar flexibilitet runt den stela bindningsfickan (fig. 3B).

Vår modell visar att den polära 17-OH-gruppen i kortisol är instoppad i ett hydrofobt område som är omgivet av Y226, P227 och L229. Denna hydroxylgrupp saknas i kortikosteron, vilket resulterar i förstärkta hydrofoba interaktioner och ∼10 gånger högre bindningsaffinitet till HSD11B2 jämfört med kortisol (Fig. S2A). Förutom i njurarna uttrycks HSD11B2 även i placenta. Även om mineralokortikoidreceptorn inte uttrycks i denna vävnad inaktiverar HSD11B2 kortisol för att eliminera dess tillväxthämmande och proapoptotiska effekter under embryonalutvecklingen. Under graviditeten kan den höga nivån av progesteron i den maternella cirkulationen binda till och modulera HSD11B2-aktiviteten. Detta kan översättas till effekter av eventuella förlust av funktionsmutationer som stör progesteronbindningen på födelsevikten. Till exempel påverkar A221V-mutationen allvarligt bindningen av progesteron mer än kortisol på grund av de steriska kollisionerna mellan Val och de projicerande metylgrupperna i progesteron (Fig. S2B). Mycket intressant är att vi finner att de två patienterna med A221V-mutationer var små i förhållande till gestationsåldern (tabell S1). På samma sätt påverkar A221G-mutationen progesteronbindningen indirekt genom att ändra bindningsställets struktur. På samma sätt är Y226N-mutationen mer skadlig för progesteronbindningen eftersom den minskar de hydrofoba interaktionerna mellan progesteronskelettet och hydroxifenylringen i tyrosin (Fig. S2B). Däremot ger P227 indirekt strukturellt stöd till bindningsstället, och mutation till Leu har liknande effekter för både kortisol och progesteron (Fig. S2B).

Det finns fyra mutationer som befinner sig i och stör koenzymbindningsstället och därmed allvarligt försämrar HSD11B2-aktiviteten. Sidokedjan för rest L179 är normalt spatialt placerad i en kort vändning mellan β4-arket och α4-helixen (fig. 3C). Genom att tillåta interaktioner med de hydrofoba sidokedjorna av V174 och L282 gör dessa interaktioner den koenzymbindande platsen mer flexibel. Mutation till Arg introducerar en guanidinium-sidokedja, vilket möjliggör interaktioner med E172:s karboxylgrupp-sidokedja och T184:s hydroxylgrupp-sidokedja (fig. 3C), vilket introducerar styvhet i vändningen och minskar den flexibilitet som krävs för optimal enzymfunktion (7). Y232 ligger i koenzymbindningsfickan och är en mycket konserverad rest i Rossmann-veckmotivet (20), vilket tyder på att dess mutation kommer att vara skadlig för enzymaktiviteten (21). Y232:s hydroxylfenylsidokedja bildar viktiga vätebindningar med N171 och NAD+, vilket håller koenzymet i rätt position för dess katalytiska funktion (fig. 3D). Denna interaktion är störd i Y232C-mutationen som orsakar allvarlig AME. Betydelsen av denna rest för enzymaktiviteten har oberoende bekräftats av flera konstruerade mutationer (21) (fig. 3D). I G89D-mutationen uppvisar Asps karboxylsidekedja allvarliga steriska kollisioner med adenosins ribosesockerdel, vilket påverkar bindningen av NAD+ (fig. 3E). En annan konstruerad mutation K236R leder till att NAD-bindningen störs (fig. 3F). Samtidigt som mutationen behåller förmågan att interagera med NAD+ genom vätebindning upphäver den enzymaktiviteten (21).

Försvagningar av den strukturella stabiliteten hos HSD11B2 stör dess tertiärstruktur, vilket leder till en markant dämpning av enzymaktiviteten och allvarlig AME. Restigen L250 är placerad i α5-helixen och dess sidokedjor sitter i en tät hydrofob ficka omgiven av sidokedjorna till L204, F246, W253, V255 och V257 (fig. 4A). Resterna i den hydrofoba fickan är låsta av en jonparinteraktion mellan R208 och E249. Införandet av en Pro-sidokedja bryter α5-helixen genom att införa styvhet. Denna ficka är också för trång för att rymma Arg:s stora, skrymmande guanidinium-sidokedja (fig. 4A). En efterföljande förlust av hydrofobicitet i denna region påverkar den strukturella stabiliteten. En annan stabil intrahelikal jonparinteraktion bildas mellan D144 och R147 (fig. 4B). Denna interaktion gör det möjligt för α3-helixen att packa tätt med de intilliggande β-bladen nära NAD+-bindningsstället. D144V-mutationen resulterar i förlust av denna interaktion och destabiliserar packningsarrangemanget (Fig. 4B). Den hydrofoba packningen störs också i F185S-mutationen, när fenylalanins aromatiska sidokedja, omgiven av hydrofoba rester av V182, C188 och M189, ersätts med en polär sidokedja av serin (fig. 4C). På samma sätt är den hydrofoba sidokedjan från L363, omgiven av M347, I350 och F362, placerad i en helix-turn-helix (fig. 4D). Mutationen L363P stör helixen och den lokala strukturella miljön.

För övrigt kan flera mutationer störa packningen av HSD11B2-proteinet för att försämra stabiliteten genom införandet av en skrymmande rest. Rest A328 bildar hydrofobisk interaktion med V215, I260, I325 och Y338 (fig. 4E). Genom att ersätta alaninet med en skrymmande Val-resurs orsakar A328V-mutationen steriska sammanstötningar med sidokedjan av I260 och Y338 från de omgivande β-bladen (fig. 4E). Residens S180 är placerad på en slinga och dess hydroxylgrupps sidokedja interagerar med sidokedjan och ryggradskvävet hos T184 (fig. 4F). Denna sidokedja ligger inom ett mycket trångt utrymme och begränsar ackommodationen av någon skrymmande rest, vilket orsakar steriska kollisioner, i själva verket utan att proteinstrukturen förändras. En Phe-sidokedja med en skrymmande aromatisk ring, som i S180F-mutationen, tolereras således inte i denna position (fig. 4F).

Mångfaldiga vätebindningar och saltbryggor mellan polära rester stabiliserar den tertiära strukturen hos HSD11B2-enzymet. Vissa mutationer orsakar en förlust av dessa interaktioner, vilket resulterar i inaktivt enzym och allvarlig AME. Till exempel är saltbryggan mellan R208 och E249 kritisk (fig. 4G). Förlusten av den, som i fallet med mutationerna R208C och R208H, destabiliserar proteinet och resulterar i allvarlig sjukdom (fig. 4G). På samma sätt bildar D223 en saltbrygga med R337 (fig. 4H). Genom att ersätta denna saltbrygga med en mindre stark bindning, en vätebindning, ändrar D223N-mutationen den negativt laddade residen till en oladdad polär rest vilket resulterar i en markant dämpning av in vitro-aktiviteten (22). Detta tyder också på att saltbryggan spelar en avgörande roll för att upprätthålla HSD11B2:s stabilitet och aktivitet. Sidokedjorna i R213 bildar vätebindningar med ryggradets atomer i resterna A331 och L329 (fig. 4I). Genom att minska dessa vätebindningar, som bidrar till att upprätthålla proteinets tertiärstruktur, försämrar R213C-mutationen enzymstabiliteten (Fig. 4I).

Arg/Tyr-klustret från resterna 335-339 har tidigare involverats i upprätthållandet av proteinets stabilitet, även om den exakta mekanismen har förblivit oklar (23). Mutationer som involverar dessa rester har rapporterats hos AME-patienter, inklusive R337C och Y338H. Simuleringar av de monomera och dimeriska HSD11B2-modellerna tyder på att rest R337 bildar en saltbrygginteraktion med D223 och vätebindningar med Y339:s OH-grupp (fig. 4J). Deras interaktioner verkar vara viktiga för att upprätthålla korrekt veckning och stabilitet hos proteinet. Således upphäver dess mutation till Cys både saltbryggan och vätebindningen för att destabilisera enzymet och orsaka allvarlig AME. Genetiskt konstruerade mutationer av denna rest visar vidare att R337K, som bibehåller polaritet och positiv laddning, minskar enzymaktiviteten med 70 %, medan R337A, som liknar R337C genom att ha oladdade och korta sidokedjor, inaktiverar HSD11B2 helt och hållet (23) (fig. 4J). I samma Arg/Tyr-kluster inaktiverar mutation av Y338 till His enzymet och orsakar allvarlig AME. Vår modell tyder på att denna Tyr-resurs bildar hydrofoba interaktioner med A328 och vätebindningar med D327 (fig. 4K). Båda interaktionerna bidrar till att upprätthålla proteinets stabilitet, så att exempelvis utbytet av Tyr mot His inaktiverar HSD11B2. Detta beror på att även om Y338H behåller vätebindningsförmågan har det kortare sidokedjor som destabiliserar enzymet. På samma sätt tolereras inte heller utbytet av Tyr mot Phe i en konstruerad Y338F-konstruktion. Här bibehålls hydrofoba interaktioner men vätebindningen avskaffas (23). Slutligen är R337 och Y338 i Arg/Tyr-klustret också mycket konserverade hos många arter; därför är det osannolikt att förändringar av dessa rester tolereras (23).

Flera mutationer rapporteras orsaka en mildare form av AME med mindre allvarliga kliniska och biokemiska manifestationer. De relevanta muterade konstruktionerna har visat sig ha bibehållen HSD11B2-aktivitet in vitro (4, 19, 24), vilket överensstämmer med den mindre allvarliga kliniska fenotypen. Strukturellt sett kan dessa mutationer antingen indirekt störa substratbindningen (t.ex. P227L-mutationen hos en av våra patienter) eller förändra proteinstrukturen (t.ex. R279C- och R359W-mutationerna) för att dämpa, men inte upphäva enzymaktiviteten (fig. 5). Särskilt anmärkningsvärt är att även om P227-restigen inte ligger i en position som direkt interagerar med substratet, tyder dess intilliggande positionering till rest Y226 på att den kan ha en roll i substratbindningen (fig. 5A). I själva verket bildar denna rest en ”knut” i loopregionen, vilket upprätthåller den aktiva platsens konformation och även håller Y226 i rätt position för att interagera optimalt med substratet. Mutation av denna rest till Leu (P227L) bryter upp knutpunkten och ändrar placeringen av Y226 (fig. 5A).

Två icke-konservativa mutationer som tros störa den tertiära strukturen hos HSD11B2 har identifierats hos patienter med AME typ 2. R279 bildar en vätebindning med N171:s ryggrad, vilket bidrar till att upprätthålla och stabilisera den lokala proteinmiljön (fig. 5B). Ersättning av R279 med en rest som inte bildar en vätebindning, som i R279C-mutationen, leder till mild dämpning, men inte total eliminering av HSD11B2-aktiviteten (24), vilket stämmer överens med en mild klinisk fenotyp (fig. 5B). En annan icke-konservativ mutation, R359W, ändrar sidokedjans egenskaper från laddad till hydrofobisk. Detta ändrar den lokala interaktionen inom proteinstrukturen, där den positivt laddade sidokedjan av R359 bildar en vätebindning med ryggradets karbonylsyre av I350 (fig. 5C). En förlust av denna interaktion bidrar till den ökade strukturella flexibiliteten, vilket orsakar en dämpning av enzymaktiviteten. Noterbart är att både R279C och R359W orsakar minimal störning av de intramolekylära interaktionerna och förekommer nära proteinets yta.