Kationiskt antimikrobiellt ε-polylysin av livsmedelskvalitet förändrar tillfälligt tarmens mikrobiella samhälle och förutspådd metagenomfunktion hos CD-1-möss

En kationisk antimikrobiell biopolymer påverkar mångfalden i tarmsamhället hos muriner

40 kvinnliga och 40 manliga 6 veckor gamla CD-1-möss delades slumpmässigt in i fyra grupper och segregerades efter kön (i.dvs. 10 honmöss och 10 hanmöss per grupp) och utfodrades med en diet med 20 % hög fetthalt kompletterad med i) enbart maltodextrin (MD) som fungerade som kontroll, ii) maltodextrin + ε-polylysin (PL), iii) maltodextrin + pektin (P) och iv) maltodextrin + ε-polylysin + pektin (PL-P). Tidigare studier har visat att möss som är inhysta tillsammans uppvisar liknande mikrobiella tarmsamhällen.38, 39 Därför samlades poolade avföringspellets från varje bur in i 24-timmars metaboliska burar och analyserades vid tre tidpunkter: vecka 1 (baslinje), vecka 5 (mellanfas) och vecka 9 (slutfas) (fig. 1). Kroppsvikt och födointag varierade inte oavsett behandlingsgrupp och under hela försöksperioden.

För att karaktärisera den fylogenetiska mångfalden sekvenserades 16S rRNA-genens V3/V4-fragment för att ge 15 739 734 kvalitetsläsningar efter filtrering.40 Detta gav ett genomsnittligt provdjup på 327 911 sekvenseringsreads per bakteriesamhälle. För att bedöma α-diversiteten inom ett givet samhälle beräknades antalet observerade operativa taxonomiska enheter (OTU) med hjälp av viktad UniFrac41 . Sällsynthetskurvor för de observerade OTU:erna (Fig. S1) närmade sig en asymptot oberoende av diet, provtagningspunkt och kön för att indikera att sekvenseringsdjupet i tillräcklig utsträckning täckte den OTU-diversitet som fanns i de samhällen som extraherades från fekalprover.

På fylumnivå utgjorde summan av Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, Firmicutes, Proteobacteria, Verrucomicrobia mer än 99 % av OTU:erna som identifierades i alla prover som analyserades. Som tidigare rapporterats42, 43 består murins tarmmikrobiom av relativt stora bidrag från fylorna Bacteroidetes och Firmicutes (fig. 2). Detta stämmer överens med andra däggdjurens tarmsamhällen, inklusive människor och icke-mänskliga primater.44, 45 De relativa abundanserna av Bacteroidetes (p < 0,05) och Firmicutes (p < 0,05) förändrades dock som svar på den särskilda kostbiopolymeren (multiway ANOVA) (fig. 2). Intressant nog uppvisade möss som utfodrades med ε-polylysin-spektinkomplexet en ökning av Bacteriodetes med 8,82 % (p < 0,05, multiway ANOVA Tukey HSD post-hoc) med en motsvarande minskning av OTU:er som tillhör Firmicutes med 11,13 % (p < 0,05, multiway ANOVA Tukey HSD post-hoc). Detta är i förhållande till den samhällsstruktur som bestämdes i den maltodextrinmatade kontrollgruppen (tabell S1). Dessutom uppvisade de möss som utfodrades med ε-polylysin (dvs. inget pektinkomplex) ett samhälle som var relativt fattigt på Firmicutes i den mellanliggande fasen (dvs. 5 veckor) av studien. Det är anmärkningsvärt att Firmicute OTU:erna återkom till den ursprungliga koncentrationen vid provtagningstillfället efter 9 veckor (baslinje: 55,24 %, mellanliggande: 34,71 %, slutlig: 59,01 %, baslinje vs. mellanliggande: p < 0,05, mellanliggande vs. slutlig: p < 0,05, multiway ANOVA Tukey HSD post-hoc) (fig. 2 och tabell S3). Genom att visa samma adaptiva svar ökade den relativa fraktionen av Bacteriodetes OTU:er tillfälligt vid fem veckors utfodring och konvergerade till de ursprungliga koncentrationerna vid den sista tidspunkten (baslinje: 35,40 %, mellanliggande: 51,18 %, slutlig: 28,82 %, baslinje vs. mellanliggande: p < 0,05, mellanliggande vs. slutlig: p < 0,05, multiway ANOVA Tukey HSD post-hoc) (fig. 2 och tabell S3). En liknande övergående ökning av Verrucomicrobia inträffade hos möss som utfodrades med enbart pektin, för att sjunka till de ursprungliga nivåerna vid den slutliga provtagningspunkten (baslinje: 0,59 %, mellanliggande: 5,46 %, slutlig: 1,01 %, baslinje vs. mellanliggande: p < 0,05, mellanliggande vs. slutlig: p < 0,05 multiway ANOVA Tukey HSD post-hoc) (fig. 2 och tabell S4). Sammantaget tyder dessa resultat på att specifika biopolymerer av livsmedelskvalitet tillfälligt styr fylumrepresentationen i murintarmen. Detta observerades när både ε-polylysin och pektin införlivades individuellt. När ε-polylysin var sammansatt med det anjoniska pektinet observerades dock inte detta fenomen. Det är anmärkningsvärt att betydande populationsflöden inom Actinobacteria, Deferribacteres och Proteobacteria inte observerades oavsett diet (tabell S5).

Förutom samhällsstörningar på fylumnivå, flyttades flera bakteriesläkten som svar på dietens biopolymerer. Detta inkluderar medlemmar av släktet Bacteroides som var de mest frekvent förekommande taxa i musens tarm (14,32 ± 9,58 % i alla prover). Totalt (för båda könen och provtagningspunkterna) varierade Bacteroides-representationen med avseende på biopolymerernas födogrupp. I likhet med svaret från fylum Bacteroidetes ökade ε-polylysin (p < 0,05, multiway ANOVA Tukey HSD post-hoc) och ε-polylysin-spektin-komplexbehandlingen (p < 0,05, multiway ANOVA Tukey HSD post-hoc) populationerna av Bacteroides spp. med 7,95 % respektive 7,46 % i jämförelse med maltodextrin-kontrollgruppen (fig. 3 och tabell S6). Andra bakteriepopulationer som modifierades av utfodringsregimer är Adlercreutzia, Lactobacillus, Turicibacter och Ruminococcus (multiway ANOVA, p < 0,05). Specifikt minskade förekomsten av Adlercreutzia oavsett biopolymer i förhållande till den maltodextrinutfodrade gruppen. Deras relativa populationer minskade med 0,18 %, 0,22 % och 0,24 % hos möss som fick ε-polylysin, pektin respektive ε-polylysin-pektinkomplex. Dessutom minskade släktet Ruminococcus signifikant med 1,39 % som svar på ε-polylysin och minskade med 1,44 % i pektingruppen. Dessutom minskade den ε-polylysin-pektin-komplexerade kosten Lactobacillus-innehållet signifikant med 4,95 %, vilket återspeglar en allmän minskning av Firmicutes i denna grupp. Detta står i kontrast till pektindieten som berikade Turicibacter i förhållande till de andra tre dieterna. En fullständig katalog över släkten som skiljer sig åt som svar på biopolymerförhållandena finns i tabell S6.

Maltodextrin används vanligen som förtjockningsmedel eller fyllmedel i olika näringstillämpningar. Denna polysackarid användes i formuleringen av alla behandlingsdieter och fungerade därmed som en kontroll för att avgöra om enbart maltodextrin skulle berika bakterier som kan hydrolysa α-1-4 glykosidiska bindningar mellan d-glukosrester. Den relativa förekomsten av Coprococcus i musens tarm berikades alltså när de konsumerade maltodextrin som ingick i deras föda. Svarsbanan omfattade en signifikant ökning mellan baslinjen och de mellanliggande provtagningspunkterna och mellan baslinjen och den sista tidspunkten (baslinjen: 0,56 %, den mellanliggande: 0,56 %, den mellanliggande: 0,56 %): 0,98 %, slutlig: 0,91 %, baslinje vs. mellanliggande: p < 0,05, baslinje vs. slutlig: p < 0,05) (fig. 3 och tabell S7).

I behandlingsgruppen som behandlades med ε-polylysin ökade den relativa förekomsten av Bacteroides övergående, vilket stämmer överens med svängningen på fylumnivå (baslinje: 8,85 %, mellanliggande: 34,40 %, slutlig: 8,74 %, baslinje vs. mellanliggande: p < 0,05, mellanliggande vs. slutlig: p < 0,05). Ett liknande svar observerades för Oscillospira (baslinje: 4,96 %, mellanliggande: 2,51 %, slutlig: 6,13 %, baslinje vs. mellanliggande: p < 0,05, mellanliggande vs. slutlig: p < 0,05). Detta kontrasteras av en övergående minskning av OTU:er som tilldelats Ruminococcus (baslinje: 2,17 %, mellanliggande: 0,97 %, slutlig: 2,10 %, baslinje vs. mellanliggande: p < 0,05, mellanliggande vs. slutlig: p < 0,05) och Adlercreutzia (baslinje: 0,49 %, mellanliggande: 0,24 %, slutlig: 0,34 %, baslinje vs. mellanliggande: p < 0,05) (figur 3 och tabell S8). Vidare uppvisade Coprococcus spp. en ihållande berikning under utfodring, med signifikanta ökningar mellan baslinjen och den sista tidpunkten (baslinje: 0,47 %, mellanliggande: 0,71 %, slutlig: 0,91 %, baslinje vs. slut: p < 0,05) (fig. 3 och tabell S8). Detta stämmer överens med samma trend som observerades inom maltodextrinkontrollgruppen. Coprococcus-populationerna förblir dock relativt statiska i musmatade pektin- och ε-polylysin-pektinkomplex.

Pektin som övergående anrikas för släktet Akkermansia (baslinje: 0,59 %, mellanliggande: 5,46 %, slutlig: 1,01 %, baslinje vs. mellanliggande: p < 0,05, mellanliggande vs. slutlig: p < 0,05) som bidrar till den observerade mellanliggande ökningen av Verrucomicrobia. Däremot minskade Adlercreutzia-populationerna vid den mellanliggande provtagningspunkten och förblev låga vid den slutliga observationen (Adlercreutzia baslinje: 0,48 %, mellanliggande: 0,23 %, slutlig: 0,26 %, baslinje vs. mellanliggande: p < 0,05). Kandidatgenus rc4-4 OTU-representationen minskade proportionellt, men uppvisade en ofullständig återhämtning till de ursprungliga nivåerna (rc4-4 baslinje: 1,94 %, mellanliggande: 1,04 %, slutlig: 1,62 %, baslinje vs. mellanliggande: p < 0,05) (figur 3 och tabell S9). Intressant nog bibehöll Ruminococcus spp. en minskande bana under hela utfodringsstudien med signifikanta skillnader mellan baslinjen och de sista tidpunkterna (baslinje: 2,32 %, mellanliggande: 1,63 %, slutlig: 1,14 %: baslinje vs. slutlig: p < 0,05) (fig. 3 och tabell S9) (fig. 3 och tabell S9).

Och även om de flesta släktena inte förändrades som svar på ε-polylysin-spektinkomplex, ökade Ocscillospira övergående innan de sjönk under de ursprungliga nivåerna (baslinje: 3,56 %, mellanliggande: 1,14 %, slutlig: p < 0,05) (fig. 3 och tabell S9): 4,70 %, slutlig: 2,44 %, mellanliggande vs slutlig: p < 0,05). Däremot hämmades Parabacteroides-populationerna i allmänhet av någon av kostbehandlingarna (utgångsvärde: 3,44 %, mellanliggande: 0,79 %, slutlig: 0,55 %, baslinje jämfört med mellanliggande: p < 0,05, baslinje jämfört med slutlig: p < 0,05). Detta liknar rc4-4 (baslinje: 2,82 %, mellanliggande: 0,77 %, slutlig: 0,48 %, baslinje jämfört med mellanliggande: p < 0,05, baslinje jämfört med slutlig: p < 0,05). Sammantaget reagerar tarmmikrobiota-släktena på tillsatser av livsmedelskvalitet på släktnivå, särskilt ε-polylysin (fig. 3 och tabell S10).

Inom att kostbiopolymerer påverkar specifika taxa hade samhällets strukturella sammansättning urskiljbara och icke slumpmässiga förändringar i aggregat. ANOSIM46 med 999 permutationer användes för att testa signifikanta skillnader mellan provgrupper baserade på viktad UniFrac.41 Som förväntat förändrade maltodextrin inte signifikant det mikrobiella samhället i murintarmen som utfodrades med denna kontroll hos varken hon- eller hanmöss (Fig. 4a, ANOSIM med 999 permutationer, p > 0,05). Pektin (Fig. 4c, ANOSIM med 999 permutationer, p > 0,05) och ε-polylysin-pektinkomplex (Fig. 4d, ANOSIM med 999 permutationer, p > 0,05) främjade inte heller några signifikanta förskjutningar inom gemenskapen. Detta står i anmärkningsvärd kontrast till de tarmmikrobiom som tillfälligt förändrades av enbart ε-polylysin. Som observerats med specifika taxonomiska grupper på fylum- och genusnivå stördes samhällsstrukturen vid femveckorstillfället för att sedan lösas upp vid den sista provtagningstillfället. Detta tyder på att populationssammansättningen korrigerades till sitt ursprungliga tillstånd genom anpassning till den kontinuerligt tillförda biopolymeren (fig. 4b, ANOSIM med 999 permutationer, p < 0,05). Detta observerades inte hos de möss som behandlades med ε-polylysin-spektinkomplex, vilket tyder på en avskärmande interaktion med det mikrobiella samhället.

ε-polylysin skiftar övergående den förutspådda metagenomfunktionen

Den metagenomiska potentialen som är inneboende i tarmmikrobiomerna härleddes genom Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) baserat på 16S rRNA-fylogenetiska data. Totalt 6 854 103 780 observationer förutsades i 6909 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ortologigrupper (KO) inom de 48 tarmsamhällen som profilerades med PICRUSt. De resulterande uppgifterna kategoriserades i 254 funktionella vägar som omfattade alla de 48 samhällena.

Totalt fanns det 44 vägar som förutspåddes att signifikant skifta övergående medan möss konsumerade ε-polylysin (ANOVA med Bonferroni-korrigering, p < 0,05) (fig. 5). Liksom när det gäller förändringar i den taxonomiska strukturen uppvisade de mellanliggande prover som togs vid 5 veckor en signifikant annorlunda profil i förhållande till baslinjen och de sista provtagningspunkterna. Bland dessa 44 vägar eller nätverk är 42 vägar involverade i bakteriell metabolism eller förutspås på annat sätt förmedla interaktioner mellan värddjur och mikroorganismer, med 18 vägar med en relativ förekomst på 0,5 % baserat på genomsnittet av de tre provtagningspunkterna (fig. 5). Av dessa förutspåddes åtta vägar minska efter fem veckor och återgå till basala nivåer vid den sista provtagningen. Omvänt uppvisade tio förutspådda vägar den motsatta trenden och ökade tillfälligt i abundans. Gener och deras vägar med anknytning till allmän transport av lösta ämnen (baslinje: 7,53 %, mellanliggande: 5,88 %, slutlig: 7,68 %, p < 0,05) och ABC-transportörer (baslinje: 3,35 %, mellanliggande: 2,76 %, slutlig: 3,44 %, p < 0,05) undertrycktes vid det mellanliggande samhällstillståndet och återgick slutligen till baslinjenivåerna. Detta tyder på att metaboliska behov och/eller miljökoncentrationer av önskvärda lösningsmedel kan minskas kortvarigt innan mikrobiomstrukturen återställs. Dessutom förutses centrala metaboliska processer som är involverade i kolhydrat- och proteinmetabolismen övergå till ett reversibelt tillstånd medan värden konsumerar den ε-polylysinberikade kosten. Detta återspeglas i glykolytiska/fermentativa vägar (baslinje: 1,05 %, mellanliggande: 1,13 %, slutlig: 1,08 %, p < 0,05), pyruvatmetabolism (baslinje: 1,01 %, mellanliggande: 1,07 %, slutlig: 1,02 %, p < 0,05).05), fruktos- och mannosmetabolism (baslinje: 0,085 %, mellanliggande: 0,099 %, slutlig: 0,089 %, p < 0,05) och gener som är associerade med oxidativ fosforylering (baslinje: 1,12 %, mellanliggande: 1,23 %, slutlig: 1,08 %, p < 0,05). Den sistnämnda KO är sannolikt involverad i anaerob andning och tillfälligt anrikad i den mellanliggande tidspunkten. Förutom kolhydratkatabolism försköts vägar som är förknippade med kväveflöde vid 5 veckor, inklusive ämnesomsättning av aminosocker och nukleotidsocker (baslinje: 1,47 %, mellanliggande: 1,60 %, slutlig: 1,50 %, p < 0,05), och histidinmetabolism (baslinje: 0,062 %, mellanliggande: 0,067 %, slutlig: 0,061 %, p < 0,05). Vi hade ursprungligen antagit att kännetecken för lysinkatabolism skulle vara berikade i de förutspådda metagenomerna hos möss som matades med ε-polylysin, antingen i PL- eller PL-P-dieten. Denna signal observerades dock inte i PICRUSt-analysen, vilket tyder på att ε-polylysin inte selekterade bakteriepopulationer som ökade den lysinkataboliska potentialen.

Där de förutsagda metagenomerna reagerade på ε-polylysin i kosten, upptäcktes inga signifikanta skillnader i de andra tre utfodringsgrupperna. Detta innefattar möss som matas med ε-polylysin som är komplext med pektin, vilket ger ytterligare stöd för elektrostatisk avskärmning för att mildra det antimikrobiella inflytandet av ε-polylysin. Enbart pektin förändrar inte samhällets struktur eller förutspådd funktion.

Värdens kön påverkar det basala mikrobiomet men inte svarsbanan

Både han- och honmöss observerades för att avgöra om biopolymeraktivitet inom mikrobiomet är könsberoende. Följaktligen koloniserade flera bakterietaxa manliga och kvinnliga djur asymmetriskt och på ett icke slumpmässigt sätt. Detta inkluderar fylum Verrucomicrobia som hittades i högre koncentrationer hos honmöss än hos hanar i aggregerad form (hona: 4,96 % av 24 prover, hane: 2,63 % av 24 prover, p < 0,05, multiway ANOVA) (tabell S11). En stor del av detta kan förklaras av skillnader i Akkermansia-populationer (hona: 4,50 %, hane: 2,63 % p < 0,05). Dessutom hyste honmöss betydligt större populationer av bakteriesläktena Parabacteroides (hona: 2,47 %, hane: 0,5 %, p < 0,05) och Bilophila (hona: 2,13 %, hane: 0,01 %, p < 0,05). Däremot koloniserades hanmöss av större koncentrationer av Odoribacter (hona: 0 %, hane: 0,92 %, p < 0,05), Turicibacter (hona: 0,02 %, hane: 0,21 %, p < 0,05), Clostridium (hona: 0,01 %, hane: 0,10 %, p < 0,05) och kandidatgenus rc4-4 (hona: 0.16 %, hane: 2,46 %, p < 0,05) (tabell S12).

Inom de taxonomiska skillnaderna finns det strukturella skillnader i samhället som kan tillskrivas djurens kön och som är uppenbara i UniFrac-avståndet som visualiseras med hjälp av huvudkoordinatanalys (PCoA) i fig. 6a. Följaktligen grupperar sig tarmmikrobiota som observerats hos kvinnliga och manliga möss tillsammans efter kön, och på ett sätt som är mer likt inom deras respektive kön än de är till varandra (Fig. 6a, ANOSIM med 999 permutationer, p < 0,05). Dessutom uppvisade hierarkisk klustring av mikrobiom och bakteriesläkten baserat på deras relativa abundans ett liknande mönster i och med att bakteriesamhällen inom samma kön tenderar att klustra (fig. S2 och S3). Den genomsnittliga fylogenetiska mångfalden inom gruppen hos honmöss är mindre än hos hanmöss (fig. 6b, t-test, p < 0,05), medan skillnader inte observerades mellan honmöss och hanmöss i det totala antalet observerade OTU:er och Chao 1-index (fig. S4).

I motsats till de strukturella skillnaderna mellan mikrobiom som hyses av honor och mikrobiom som hyses av hanar varierade endast tre förutspådda metagenomiska vägar signifikant. Detta inkluderar transkriptionsrelaterade operationer (kvinna: 0,0092 %, man: 0,0051 %, p < 0,05), biosyntes av aminoglykosidantibiotika (kvinna: 0,087 %, man: 0,080 %, p < 0,05) och glycerofosfolipidmetabolism (kvinna: 0,55 %, man: 0,52 %, p < 0,05). Det är oklart om dessa ligger bakom uttryckta metaboliska skillnader mellan de två värdkönen. Bevarande av funktion trots taxonomisk variation överensstämmer med redundans i genetisk potential som tidigare observerats inom andra mikrobiella samhällen.46, 47

Trots könsberoende funktioner förblir den specifika effekten av biopolymerbehandlingar oberoende av kön, vilket indikeras av PCoA-analysen (fig. 3). Specifikt ändrar ε-polylysin övergående murinmikrobiomet vid den mellanliggande provtagningspunkten oberoende av kön. Medan pektin eller pektin komplexerat med ε-polylysin inte förändrar kvinnliga och manliga mössens mikrobiota. En liknande responsväg är tydlig i flöden på fylumnivå, eftersom Bacteriodes- och Firmictues-representationen tillfälligt förskjuts som svar på ε-polylysin hos båda könen (fig. S5). Dessutom uppvisade tarmmikrobiomerna från båda könen samma förändring i Verrucomicrobia när de matades med pektin (fig. S5). I förhållande till den maltodextrinmatade gruppen ökade den ε-polylysin-pektinkomplexa kosten dessutom Bacteriodetes och minskade Firmicutes oberoende av kön. Dessa resultat tyder på att könsberoende egenskaper (t.ex. hormoner) inte verkade synergistiskt eller antagonistiskt med biopolymerer i kosten för att förändra samhällsstrukturen totalt sett och inom de viktigaste fylerna.

Interessant nog kan biopolymerer i kosten förändra genusrepresentationen, som i viss mån är beroende av kön. Den relativa förekomsten av Parabacteroides (kön*behandling p < 0,05, multiway ANOVA), Clostridium (kön*behandling p < 0,05, multiway ANOVA), Coprococcus (kön*behandling, p < 0,05, multiway ANOVA) och Bilophila (kön*behandling p < 0,05, multiway ANOVA) uppvisade ett blygsamt beroende av värdkönet (fig. S6). Hos honmöss var Coprococcus-innehållet högre i pektingruppen jämfört med de andra tre grupperna hos honmöss (MD: 0,69 %, PL: 0,63 %, P: 0,98 %, PL+P: 0,65 %, MD vs. P: p < 0,05, PL vs. P: p < 0,05, P vs. PL+P: p < 0,05). Hos hanmöss minskade dock Coprococcus OTU i pektingruppen i mikrobiomerna jämfört med de andra tre grupperna (MD: 0,94 %, PL: 0,77 %, P: 0,45 %, PL+P: 0,78 %, MD vs. P: p < 0,05, PL vs. P: p < 0,05, P vs. PL+P: p < 0,05). Bilophila minskade också hos honmöss som fick ε-polylysin i förhållande till ε-polylysin-spektin-komplexdiet (MD: 0,51 %, PL+P: 1,63 %, p < 0,05), medan mikrobiomet hos hanmöss inte uppvisade detta könsrelaterade populationsflöde. Dessutom påverkade interaktionerna mellan kön, provtagningspunkter och biopolymer den observerade relativa abundansen av släktena Turicibacter (p < 0,05), Clostridium (p < 0,05), Coprococcus (p < 0,05) och kandidatsläktet rc4-4 (p < 0,05).