Hämning av MDM2 via Nutlin-3A: En potentiell terapeutisk metod för pleurala mesoteliom med MDM2-inducerad inaktivering av Wild-Type P53

Abstract

Vår grupp har tidigare visat att kärnuttryck av E3 ubiquitinligas (MDM2) i malignt pleuralt mesoteliom (MPM) är signifikant förknippat med minskad total överlevnad. En möjlig förklaring kan vara att överuttryck av MDM2 leder till en proteasomal nedbrytning av TP53 som slutligen resulterar i en förlust av TP53-inducerad apoptos och senescens. Det är välkänt från andra tumörenheter att återställande av TP53-aktivitet, t.ex. genom MDM2-hämning, resulterar i en omedelbar TP53-inducerad stress- och/eller DNA-skadereaktion hos cancerceller. Nutlin-3A (en cis-imidazolinanalog) har beskrivits som en potent och selektiv MDM2-hämmare som förhindrar MDM2-TP53-interaktion genom specifik bindning till MDM2:s hydrofoba TP53-bindningsficka. I denna studie testades effekterna av MDM2-hämning i MPM via Nutlin-3A och standard platinabaserade kemoterapeutika jämförande i tre MPM-cellinjer (NCI-H2052, MSTO-211H och NCI-H2452) som uppvisar olika uttrycksprofiler av TP53, MDM2 och dess fysiologiska hämmare av MDM2-P14/ARF. Våra in vitro-experiment på MPM-cellinjer visade att Nutlin-3A i kombination med cisplatin resulterade i upp till 9,75 gånger högre induktion av senescens (p=0,0050) och upp till 5 gånger högre apoptosfrekvens (p=0,0067) jämfört med de vanligen tillämpade regimerna av cisplatin och pemetrexed. Nutlin-3A, en potent hämmare av MDM2, är således förknippad med en betydande induktion av senescens och apoptos i MPM-cellinjer, vilket gör Nutlin-3A till en lovande substans för en riktad terapi i den undergrupp av MPM som uppvisar MDM2-överuttryck.

1. Introduktion

Malignt mesoteliom är en mycket aggressiv tumör som uppstår från mesotelförsedda ytor, mestadels från pleurahålorna (malignt pleuramesoteliom, MPM) . När de är obehandlade är medianöverlevnaden för patienterna nio månader . MPM-patienter påverkas negativt av de oftast otillräckliga nuvarande behandlingsmetoderna som består av platinainnehållande regimer med cisplatin eller karboplatin som förstahandsval. Cisplatinbehandling resulterar i en svarsfrekvens på endast 14 % och en medianöverlevnad på mindre än sju månader . Karboplatin ger liknande svarsfrekvenser på mellan 6 och 16 %. I klinisk praxis används antifolatet pemetrexed, som den enda FDA-godkända terapin för MPM, i kombination med platinföreningar .

Flera studier har visat att utvärderingen av intratumoralt uttryck av medlemmar av folsyrametabolismen är effektiv för att förutsäga responsen på multitargeted antifolaterapi hos patienter med olika cancerformer, men diskuteras kontroversiellt . Eftersom platinanaloger är genotoxiska föreningar som inducerar DNA-skador som leder till TP53-inducerat cellcykelstopp och apoptos är det i princip tänkbart att DNA-reparationsmekanismen kan vara en av de nycklar som förknippas med ett försämrat terapisvar. Eftersom identifiering av molekylära egenskaper som delas av MPM kan bidra till att övervinna det dåliga behandlingssvaret som observerats, har flera studier behandlat denna fråga . Orsakerna till den ganska dåliga effekten av platinaföreningar är dock fortfarande till stor del okända.

Sammanfattningsvis finns det hittills varken tillförlitliga prediktiva biomarkörer eller individualiserade terapeutiska koncept för MPM. Därför betonar nuvarande riktlinjer behovet av innovativa och nya terapier.

Med tanke på att mutationer i TP53-genen är ytterst sällsynta vid MPM , kan andra mekanismer, t.ex. deletion av lokus eller epigenetiska förändringar, bidra till inaktivering av TP53 . Överuttryck av MDM2 i vissa tumörtyper kan leda till en förlust av TP53:s reglerande funktion i cancerceller genom dess ökade proteasomala nedbrytning . P14/ARF, den fysiologiska inhibitorn av MDM2, är erkänd som en tumörsuppressor och bidrar till denna mekanism genom att inducera cellcykelstopp på både ett TP53-beroende och TP53-oberoende sätt. Dessutom verkar miRNA-reglering spela en viktig roll . I tidigare studier har vi påvisat ett starkt nukleärt MDM2-överuttryck i cirka 25 % av MPM; denna observation var begränsad till epithelioid MPM eller de epithelioida komponenterna i bifasisk MPM . Patienter med MDM2-positiv MPM uppvisade en signifikant minskad total överlevnad (OS) och progressionsfri överlevnad (PFS) jämfört med MDM2-negativ MPM . Detta kan förklaras av en betydligt minskad eller helt upphävd TP53-aktivitet och/eller stabilitet som förmedlas av ett överuttryck av MDM2 .

Ett återställande av TP53-aktiviteten, t.ex. genom MDM2-hämning, kan resultera i en omedelbar TP53-inducerad stress- och/eller DNA-skadereaktion hos cancercellerna. Nutlin-3A (en cis-imidazolinanalog) är en potent och selektiv MDM2-hämmare med ett IC50-värde på 90nM och förhindrar MDM2-TP53-interaktion genom att binda till MDM2:s hydrofoba TP53-bindningsficka .

Syftet med denna studie var därför att testa effekten av MDM2-hämning i MPM via Nutlin-3A i jämförelse med dagens vanliga kemoterapeutiska strategier med hjälp av tre cellinjer som uppvisar olika markörprofiler avseende TP53-status, P14/ARF- och MDM2-uttrycksnivå.

2. Material och metoder

2.1. Celllineexperiment

Baserat på en genomgång av litteraturen uppskattades koncentrationerna för cytostatika (Nutlin-3A , cisplatin respektive pemetrexed ).

Humana MPM-cellinjer erhölls från American Type Culture Collection 2012-08 (Manassas, VA, USA). Cellinjerna autentiserades och testades för föroreningar med hjälp av en kommersiell tjänst (Multiplexion, Heidelberg, Tyskland) och testades senast på nytt direkt efter att experimenten avslutats.

NCI-H2052, NCI-H2452 och MSTO-211H odlades i Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-medium (Invitrogen, CA, USA) som innehöll 10 % fetalt bovint serum (Invitrogen) vid 37 °C i en 5 % CO2-avfuktad atmosfär. Cellerna odlades till 85-95 % konfluens, tvättades sedan med fosfatbuffrad saltlösning (Invitrogen) och trypsiniserades med 1 ml 0,05 % trypsin-0,53 mM etylendiamintetraättiksyra, fenolrött (Invitrogen). Trypsiniseringen stoppades genom att man tillsatte nytt medium till reaktionen. Cirka 10 μl överfördes till en hemocytometer (BRAND, Wertheim, Tyskland) för cellräkning. 1 000 celler per brunn (100 μl) såddes i mikroplattor 96/U (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) lämpliga för luminescens- och fluorescensdetektion. Cellerna fick fästa över natten vid 37 °C och 5 % CO2. Nästa dag avlägsnades mediet och färskt medium som innehöll antingen en av cytostatika eller utan tillsats applicerades i varje brunn. Cisplatin (10μM; TEVA, Petah Tikva, Israel), pemetrexed (200μM; Lilly, IN, USA) och Nutlin-3A (5, 10 eller 20μM; Sigma-Aldrich, MO, USA) applicerades antingen ensamma eller i kombination. Nutlin-3A måste lösas upp i dimetylsulfoxid (Sigma-Aldrich). Koncentrationerna av de applicerade cytostatika sammanfattas i tabell 1. Cellkulturer som innehöll cytostatika och blankmedium inkuberades i tre dagar vid 37 °C och 5 % CO2. Inom 72 timmar bedömdes nekros, apoptos och cellviabilitet med hjälp av följande luminescensanalyser: CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay (Promega), Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega) och CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega). Testerna utfördes enligt rekommendationerna från leverantören. För varje cytostatika och luminescensanalys mättes minst fyra datapunkter. Luminescensen bedömdes med en SpectraMax L Luminescence Microplate Reader (Molecular Devices, CA, USA). Luminescensen (relativa luminescensenheter; RLU) mättes vid 570 nm och integrationstiden justerades till 1 sekund. SpectraMax L:s temperatur hölls mellan 21,5 °C och 24,5 °C under mätningarna. Från varje cellinje framställdes dessutom ett FFPE-block för immunohistokemisk och qPCR-analys.

2.2. RNA-isolering och realtids qPCR

Expressionsnivåerna för ACTB (referensgen), MDM2 och P14/ARF, undersöktes med TaqMan realtids qPCR i de tre MPM-cellinjerna. Därför isolerades RNA genom att skära tre till fem sektioner på 4 μm från FFPE-blocket med hjälp av en mikrotom (Leica, SM 2000 R, Wetzlar, Tyskland). Totalt RNA isolerades med hjälp av miRNeasy FFPE-kitet (Qiagen, Hilden, Tyskland) och tillverkarens protokoll, med undantag för två ändringar (proteinas K-desmältning över natten; eluering i 25μl). RNA-koncentrationerna mättes med hjälp av UV/VIS-spektrometri (NanoDrop ND-1000, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Tyskland). RNA förvarades vid -80 °C. För cDNA-syntes användes iScript Select cDNA-synteskit och protokoll (Bio-Rad Laboratories, Inc, CA, USA) användes med en insats av 1 μg totalt RNA per reaktion.

För qPCR i realtid användes TaqMan Gene Expression Assays on Demand (AoD) för ACTB (Hs03023943_g1), MDM2 (Hs01066942_m1) och P14/ARF (Hs99999189_m1) (Applied Biosystems®; CA, USA). Reaktionsvolymerna ändrades genom att använda 50 % av de rekommenderade totala reaktionsvolymerna med 50 ng cDNA-input. Varje mål mättes i tre exemplar. Ct-värdena för P14/ARF och MDM2 normaliserades till medelvärdena för ACTB. qPCR i realtid och dataanalys utfördes på en Roche LightCycler 480 II (Roche, Basel, Schweiz) och motsvarande programvara. Alla qPCR-experiment i realtid utfördes i enlighet med MIQE-riktlinjerna .

2.3. Immunohistokemi

Immunohistokemi utfördes enligt standardprotokoll med en automatiserad färgare (Ventana Discovery XT, München, Tyskland). Efter validering på referensvävnader (liposarkom för MDM2, lungadenokarcinom för TP53) utfördes de immunohistokemiska undersökningarna med antikroppar riktade mot MDM2 (klon IF2, Calbiochem, Darmstadt, Tyskland, utspädning: 1:80) och TP53 (klon BP53-12, Zytomed, Berlin, Tyskland, utspädning: 1:5000). Förbehandling för antigenhämtning utfördes genom uppvärmning i avjoniserat vatten vid pH 6 i 30 minuter. Proteinuttrycket bedömdes med hjälp av ett IHC-poängsystem i fyra steg baserat på andelen tumörcellskärnor med en positiv immunreaktion (poäng 0: ingen signal; poäng 1 (svagt uttryck): 1-25 %; poäng 2 (måttligt uttryck): 26-50 %; poäng 3 (starkt uttryck): >50%).

2.4. Statistisk analys

Statistiska och grafiska analyser utfördes med den statistiska programmeringsmiljön R (v3.4.2).

För analys mellan enskilda grupper tillämpades antingen Wilcoxon Mann-Whitney rangsummetest (icke-parametriskt) eller tvåsidigt students t-test (parametriskt). För ordinala variabler med mer än två grupper (skillnader i luminescenssignal mellan alla behandlingsgrupper) användes antingen Kruskal-Wallis-testet (icke-parametriskt) eller ANOVA (parametriskt) för att upptäcka gruppskillnader.

Nivån för statistisk signifikans definierades som p<0,05.

3. Resultat

Uttrycksprofilerna för MDM2, TP53 och P14/ARF skiljer sig åt mellan de undersökta cellinjerna och sammanfattas i tabell 2. Skanningar av immunohistokemiska färgningar visas i figur 1; qPCR-resultat visualiseras i figur 2. NCI-H2052 uppvisade ett uttalat MDM2-immunoexpression, men lite P14/ARF- och TP53-expression. Immunohistokemiskt visade MSTO-211H inget uttryck av MDM2 och P14/ARF, men TP53-expression fanns. NCI-H2452 visade varken MDM2- eller TP53-uttryck, men P14/ARF-uttryck påvisades. De undersökta cellinjerna representerar den molekylära konstellation som rapporterats i tidigare studier av patienter med MPM .

(a) NCI-H2052, anti-P53-färgning

(b) NCI-H2052, anti-MDM2-färgning

(c) NCI-H2452, anti-P53-färgning

(d) NCI-H2452, anti-MDM2-färgning

(e) MSTO-211H, anti-P53-färgning

(f) MSTO-211H, anti-MDM2-färgning

(a) NCI-H2052, anti-P53-färgning
(b) NCI-H2052, anti-MDM2-färgning
(c) NCI-H2452, anti-P53-färgning
(d) NCI-H2452, anti-MDM2-färgning
(e) MSTO-211H, anti-P53-färgning
(f) MSTO-211H, anti-MDM2-färgning

Figur 1

Immunohistokemisk färgning av de undersökta MPM-cellinjerna med antikroppar riktade mot P53 och MDM2. NCI-H2052 visar en stark färgning (poäng 2) av P53 (a) och MDM2 (b). NCI-H2452 visade varken immunoexpression för P53 ((c), poäng 0) eller för MDM2 ((d), poäng 0). MSTO-211H färgade positivt för P53 ((e), resultat 1) och MDM2 ((f), resultat 1). Skalstrecken anger 100 μm för bilderna (a) och (b) och 500 μm för bilderna (c), (d), (e) och (f).

3.1. Svar från MPM-cellinjer på pemetrexed, cisplatin och varierande Nutlin-3A-koncentrationer

Cisplatin (10μM) och pemetrexed (200μM) som enskild substans samt i kombination testades mot tre Nutlin-3A-koncentrationer (5μM, 10μM och 20μM).

3.1.1. Cellviabilitet

NCI-H2052. Alla Nutlin-3A-koncentrationer var överlägsna när det gällde att minska cellviabiliteten jämfört med antingen cisplatin eller pemetrexed respektive deras kombination (p=0,0039). Däremot visade behandling med enbart pemetrexed en signifikant förhöjd cellviabilitet. Behandling med enbart cisplatin visade högre cellviabilitet än cisplatin och pemetrexed i kombination.

MSTO-211H. Pemetrexed i kombination med cisplatin var förknippat med den högsta cellviabiliteten, följt av enbart cisplatin och den lägsta Nutlin-3A-koncentrationen (p=0,0952). Pemetrexed i kombination med cisplatin minskade cellviabiliteten avsevärt, men Nutlin-3A (10μM) uppvisade en något starkare minskning. Den högsta Nutlin-3A-koncentrationen minskade cellviabiliteten till ett minimum.

NCI-H2452. Den högsta Nutlin-3A-koncentrationen (20μM) minskade cellviabiliteten till ett minimum (p=0,0017). 10μM Nutlin-3A var den näst starkaste cellviabilitetshämmaren följt av enbart cisplatin, enbart pemetrexed och cisplatin i kombination med pemetrexed. Den lägsta Nutlin-3A-koncentrationen visade den svagaste effekten på minskad cellviabilitet.

Box-plottar för cellviabilitet belyser minskad cellviabilitet med ökande Nutlin-3A-koncentration i de testade cellinjerna. Resultaten för alla cellinjer avseende senescens/cellviabilitet sammanfattas i figurerna 3(a)-3(c).

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Figur 3

Induktion av senescens i MPM-cellinjer av pemetrexed, cisplatin och varierande Nutlin-3A-koncentrationer samt varierande Nutlin-3A-koncentrationer i kombination med cisplatin. Figur 3 visar boxplots för cellviabilitet/senescens för de tre undersökta MPM-cellinjerna. På y-axeln visas RLU (relativa luminescensenheter). Höga RLU indikerar hög cellviabilitet, medan låga RLU indikerar senescens. På x-axeln visas koncentrationerna av de cytostatika som använts och kontrollen. I alla tre MPM-cellinjerna visade 20μM Nutlin-3A den starkaste hämmningen av cellviabiliteten jämfört med de andra cytostatika med enskild verkan och de tillämpade koncentrationerna. Detta gäller mot andra Nutlin-3A-koncentrationer (NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,007, NCI-H2452: p<0,001), cisplatin (NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,018, NCI-H2452: p=0,018).004), pemetrexed (NCI-H2052: p=0,032, MSTO-211H: p=0,008, NCI-H2452: p=0,006) och en kombination av båda (NCI-H2052: p=0,003, MSTO-211H: p=0,002, NCI-H2452: p<0,001). Dessutom visade högre koncentrationer av Nutlin-3A (10μM, 20μM) i kombination med cisplatinregimen den starkaste hämmningen av cellviabiliteten jämfört med numera godkända cytostatika, antingen som enskilda medel (cisplatin: NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,022, NCI-H2452: p=0,006; pemetrexed: NCI-H2052: p=0,014, MSTO-211H: p=0,029, NCI-H2452: p<0,001) eller i kombination (NCI-H2052: p=0,003, MSTO-211H: p=0,014, NCI-H2452: p<0,001).

3.1.2. Apoptosis

NCI-H2052. I cellinjen NCI-H2052 hittades den högsta apoptosfrekvensen för 20μM Nutlin-3A, medan de andra behandlingsmetoderna visade liknande apoptosinduktion (p=0,14).

MSTO-211H. I MSTO-211H hittades den högsta apoptosfrekvensen för pemetrexed följt av pemetrexed i kombination med cisplatin och olika Nutlin-3A-koncentrationer (p=0,0219). Nästan ingen apoptos observerades för enbart cisplatin och Nutlin-3A.

NCI-H2452. NCI-H2452 uppvisade den högsta apoptosfrekvensen som svar på Nutlin-3A i den högsta koncentrationen (20μM) följt av cisplatin (p=0,0359). Betydligt lägre apoptosfrekvens hittades för de återstående cytostatika.

Resultaten för apoptos sammanfattas i figurerna 4(a)-4(c).

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

3.1.3. Nekros

Nekros av celler påverkades inte av någon av de kemoterapeutiska substanserna jämfört med kontrollen (data visas inte).

3.2. Svar från MPM-cellinjer på varierande Nutlin-3A-koncentrationer i kombination med cisplatin

I ytterligare experiment testades induktionen av apoptos genom att använda antingen en Nutlin-3A-regim eller en kombination av Nutlin-3A och cisplatin. Tre kombinationer av Nutlin-3A (5μM, 10μM och 20μM) plus cisplatin (10μM) jämfördes med enbart cisplatin (10μM), enbart pemetrexed (200μM), enbart Nutlin-3A (10μM) och en kombination av cisplatin och pemetrexed.

3.2.1. Cellviabilitet

NCI-H2052. Nutlin-3A ensam och dess kombination med cisplatin visade signifikant ökad induktion av senescens jämfört med den andra regimen (p=0,0051). Endast 5μM Nutlin-3A i kombination med cisplatin visade lägre potens för att inducera senescensfrekvenser än 5μM Nutlin-3A utan cisplatin. De högre Nutlin-3A-koncentrationerna (10 och 20μM) med cisplatin minskade cellviabiliteten till ett minimum. Den högsta cellviabiliteten hittades för pemetrexed följt av kombinationen av pemetrexed och cisplatin.

MSTO-211H. Varje kombination av Nutlin-3A med cisplatin inducerade signifikant ökad cellulär senescens jämfört med cisplatin, pemetrexed eller en kombination av båda (p=0,0059). Kombinationen av cisplatin och pemetrexed visade dock liknande effekt jämfört med den lägsta Nutlin-3A/cisplatin-regimen och enbart Nutlin-3A. Högre koncentrationer av Nutlin-3A i kombination med cisplatin minskade cellviabiliteten till ett minimum.

NCI-H2452. Nutlin-3A i kombination med cisplatin eller ensam var överlägsen jämfört med de andra cytostatika, utom vid den lägsta koncentrationen 5μM (p=0,0089). Intressant nog visade cisplatin jämförbar effekt som 10μM Nutlin-3A ensam och cisplatin i kombination med 5μM Nutlin-3A. Den högsta cellviabiliteten observerades med pemetrexed, cisplatin i kombination med pemetrexed och 5μM Nutlin-3A. Den högsta Nutlin-3A-koncentrationen (20μM) med cisplatin uppvisade den högsta senescenshastigheten.

Box plots för cellviabilitet belyser att cellviabiliteten minskade med ökande koncentration av cisplatin/Nutlin-3A-regimen i de testade cellinjerna. Resultaten för senescens/cellviabilitet sammanfattas i figurerna 3(a)-3(c).

3.2.2. Apoptosis

NCI-H2052. I cellinjen NCI-H2052 inducerade högre Nutlin-3A-koncentrationer i kombination med cisplatin som applicerades signifikant ökad apoptos jämfört med enbart pemetrexed eller i kombination med cisplatin (p=0,0069). De högsta apoptosnivåerna hittades för 10μM Nutlin-3A i kombination med cisplatin.

MSTO-211H. Cellinjen MSTO-211H uppvisade den högsta apoptosen vid behandling med enbart pemetrexed (p=0,0035). Den näst högsta apoptosfrekvensen hittades för 10μM Nutlin-3A i kombination med cisplatin. Pemetrexed i kombination med cisplatin resulterade i den tredje högsta apoptosfrekvensen. Cisplatin i kombination med 20μM Nutlin-3A var mer potent än enbart cisplatin, enbart Nutlin-3A och den lägsta koncentrationen av Nutlin-3A (5μM) i kombination med cisplatin.

NCI-H2452. Den högsta apoptosfrekvensen hittades för 20μM Nutlin-3A som enskilt medel samt 10μM och 20μM Nutlin-3A-koncentrationer i kombination med cisplatin, följt av cisplatin (p=0,1).

Resultaten avseende apoptos sammanfattas i figurerna 4(a)-4(c).

3.2.3. Nekros

Nekros av cellerna påverkades inte av någon av kemoterapeutika jämfört med den obehandlade kontrollen (data visas inte).

Alla resultat av cellinhibitionsförsöken sammanfattas i tabell 3.

4. Diskussion

I tidigare studier identifierade vi MDM2 som en prognostisk biomarkör hos patienter med MPM och att uttrycket regleras genom specifika miRNA . Nutlin-3A hämmar MDM2-TP53-interaktionen och inducerar därmed cellcykelstopp, senescens och apoptos beroende på celltyp . Dessutom är det ett icke genotoxiskt läkemedel som uppvisar liten toxicitet i djurmodeller och är förknippat med en lägre risk för resistens än konventionella läkemedel .

Mot denna bakgrund antog vi att MDM2-överuttryck, kanske i kombination med partiell eller fullständig förlust av P14/ARF, kan vara målet för en Nutlin-3A-baserad behandlingsregim för att återställa TP53-aktiviteten i en subgrupp av MPM.

I denna in vitro-ansats undersöktes effekterna av de numera modernaste kemoterapeutiska läkemedlen cisplatin och pemetrexed, ensamma och i kombination, jämfört med Nutlin-3A, i tre cellinjer som täcker det mönster som hittas hos patienter. Nutlin-3A framkallade effektivt senescens i alla tre MPM-cellinjerna och var överlägsen jämfört med cisplatin och/eller pemetrexed, medan apoptos endast kunde framkallas vid höga koncentrationer. Det är känt från litteraturen att effekterna av Nutlin-3A är celltypspecifika och att de snarare inducerar cellcykelstopp och senescens än apoptos. Följaktligen undersökte vi cisplatin och Nutlin-3A i kombination för att öka den cellulära stressen genom att framkalla platinbaserade DNA-skador. Kombinationen av Nutlin-3A med cisplatin resulterar i ökad apoptos och senescens jämfört med enbart Nutlin-3A, eftersom en viktig funktion hos TP53 är DNA-skador och stressrespons .

Samma mekanism tycks gälla när Nutlin-3A kombineras med strålbehandling för att ge ytterligare cellskador och förskjuta det cellulära TP53-svaret mot apoptos, vilket redan har visats i esofagealt skivepitelcellscancer av TP53-wildtyp in vitro och in vivo . Intressant nog fann Shimazu et al. en ytterligare tillväxthämmande effekt i MPM när Nutlin-3A kombinerades med metformin, en mTOR-hämmare, vilket tyder på en möjlig korsverkan mellan mTOR- och TP53-systemet. Noterbart är att författarna bekräftade våra fynd av cellinjerna NCI-H2052 och MSTO-211H som bäst svarar på Nutlin-3A-behandling och postulerade ett IC50-värde på 0,37μM (MSTO-211H) respektive 0,50μM (NCI-H2052) .

Som tidigare nämnts kan överuttryck av MDM2 leda till en förlust av den regulativa P53-funktionen via ökad proteasomal nedbrytning . Förutom dess fysiologiska hämmare P14/ARF visar analysen av signalförhållandet mellan dessa gener på en ytterligare roll för RB1 i detta signalnätverk . Det har visats att Nutlin-3A förutom att hämma MDM2-TP53-interaktionen även påverkar MDM2-RB1-interaktionen, vilket gör detta till en möjlig förklaring till Nutlin-3A-baserade TP53-oberoende effekter .

Interessant nog uppvisar till och med den cellinje med lågt MDM2-uttryck MSTO-211H samt den MDM2- och TP53-negativa cellinjen NCI-H2452 minskad, men tydligt påvisbar, induktion av apoptos genom Nutlin-3A i kombination med cisplatin. Immunohistokemiskt negativa celler har också, som tidigare rapporterats, ett påvisbart genuttrycksmönster för MDM2, vilket resulterar i MDM2-proteinkoncentrationer som ligger under IHC:s detektionsgräns. Vi antar att eftersom MDM2-driven reglering av TP53 är en viktig mediator för apoptos och celltillstånd i en fysiologisk situation, kommer även inhibering av TP53-MDM2-interaktionen vid dessa låga MDM2-nivåer att ha en gynnsam effekt på cytotoxiciteten hos platinaföreningar, vilket förklarar de uppkomna biverkningarna av Nutlin-3A-behandling . För NCI-H2452, en cellinje utan uttryck av TP53, måste den observerade effekten vara TP53-oberoende och är sannolikt baserad på RB1-hämmande effekter.

För närvarande administreras Nutlin-3A per os som substans R0504545337 i en klinisk multicenterfas I-studie för behandling av hematologisk neoplasi . Dessutom har RG7112, ett derivat av Nutlin-3A, gått in i kliniska fas I-prövningar på patienter med liposarkom som är tumörer av TP53-wildtyp med förstärkt MDM2 . I denna kliniska prövning administrerades RG7112 per os till 20 patienter i en neoadjuvant miljö . En patient visade partiell remission och 14 visade stabil sjukdom, men alla patienter drabbades av biverkningar som neutropeni . En möjlig förklaring kan vara de höga läkemedelsdoserna på 1440 mg m-2 dag-1 per os . I tidigare in vivo-studier visade oral administrering av Nutlin-3A flera begränsningar som höga mängder Nutlin-3A (200-400 mg/Kg) och svårigheter att administrera dessa höga doser . Det är värt att notera att effektiva leveranssystem har utvecklats med hjälp av polymerer som poly(lactide-co-glykolid) (PLGA) och monoklonala antikroppar .

5. Slutsats

I denna in vitro-studie bevisades vår hypotes att MDM2-överuttryckande MPM kan riktas mot en Nutlin-3A-baserad kemoterapi. Särskilt för en optimal biomarkörinställning av MDM2-överexpression och lågt/frånvarande P14/ARF-uttryck sågs överlägsna apoptos- och senescensfrekvenser jämfört med de konventionella kemoterapeutiska läkemedlen. Även för en mindre optimal biomarkör med minimalt MDM2-uttryck var en gynnsam induktion av apoptos och senescens uppenbar för Nutlin-3A i kombination med cisplatin jämfört med den konventionella läkemedelsbehandlingen. Därför kan Nutlin-3A-baserad behandlingsstrategi vara av stort värde för en subgrupp av patienter med MPM.

Datatillgänglighet

Data som används för att stödja resultaten i denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på begäran.

Offentliggörande

Resultaten av denna studie har presenterats vid det tyska cancerkonsortiet (DKTK), 1st Essen Translational Oncology Symposium (ETOS) (Essen, 2018) och den 33:e tyska cancerkongressen (Berlin 2018).

Intressekonflikter

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Ansvar

Studien har finansierats av Institutet för patologi, Universitetssjukhuset Essen och Ruhrlandklinik Essen.