Resultat
Snabb ATP-bindning till GroEL som avslöjas av fluorescensintensitetsförändringar av GroEL F44C märkt med Oregon Green 488.
För att övervaka bindning av ATP av GroEL förlitade vi oss på en tidigare producerad GroEL-variant, F44C, som innehåller en enda cystein i en annars ”cystein-noll”-version av GroEL där alla tre naturliga cysteinerna i GroEL-underenheten (aminosyrorna 138, 458 och 519) hade ersatts med alanin (21). Som illustreras i figur 1A ligger F44 i en slinga som pekar uppåt i GroEL:s centrala kavitet i nivå med den ekvatoriala domänen, placerad mellan ekvatoriala antiparallella β-strängar i närheten av vars ändar det finns rester som bildar vätebindningskontakter med den terminala fosfaten i bundet ATP genom en vattenmolekyl och en kaliumjon. Slingan och rest 44 är således disponerade för att påverkas av frånvaron respektive närvaron av ATP. I en tidigare studie rapporterades att en F44W-substitution kunde rapportera om ATP-bindning (16). Här använde vi mutanten F44C, som tidigare hade observerats vara fullt funktionell, vilket framgår av förmågan hos dess kodande plasmid att rädda tillväxten hos en GroEL-bristfällig mutant och av det renade proteinets förmåga att utföra en effektiv ATP/GroES-beroende proteinåteruppveckning in vitro (21). F44C märktes med Oregon Green 488 (OG488)-maleimid till en nivå av ≈70 % beläggning. Den förblev fullt funktionell för att förmedla återvikning av malatdehydrogenas (MDH) in vitro och uppvisade en kinetik som var nästan identisk med kinetiken för WT GroEL . Den modifierade mutantens, kallad EL44-OG, steady-state-hastighet för ATP-omsättning liknade också den för WT GroEL (Fig. S1B).
ATP binder snabbt till oligandad GroEL och till transringen i GroEL/GroES/ADP-komplexet. (A) Banddiagram av en del av den ekvatoriala domänen för 1 GroEL-underenhet i GroEL/GroES/ADP/AlFx-komplexet (ref. 24; PDB ID-kod: 1PCQ) som visar positionen för F44. (B) Emissionsspektra av EL44-OG ensam (svart spår), blandad med 500 μM ADP (grönt) och blandad med 500 μM ATP (rött). Uppväckning skedde vid 496 nm. (C) Förändring av EL44-OG:s fluorescens vid stoppad flödesblandning med ATP. Spåret kunde anpassas (vit linje) som summan av två exponentialer med de hastighetskonstanter som visas. Schemat visar OG (grönt) i de ekvatoriala domänerna. (D) Beroende av den snabbare hastigheten för fluorescensförändringen på ATP-koncentrationen. Hastighetskonstanter från experiment som i C (svart) och E (röd) vid olika ATP-koncentrationer plottas som en funktion av ATP-koncentrationen, vilket ger räta linjer med lutningar som är lika med respektive andra ordningens hastighetskonstanter för ATP-bindning, som visas. (E) Förändring av fluorescensen hos EL44-OG/GroES/ADP-komplexet vid stoppad flödesblandning med ATP. D representerar ADP i cis-ringen, GroES är grått färgat och ATP (rött) visas intill den ring som det binder till. (F) Som i E, förutom med oligandad EL44-OG. (G) Som i E, men med MDH bunden till trans-ringen, representerad som en blå linje i schemat. (H) Stopped-flow-blandningsexperiment som liknar det i E, förutom att GroEL i komplexet märktes med OG på position 315 på utsidan av de apikala domänerna. Här kunde spåret anpassas som en enda exponential med den angivna hastigheten. (I) Stoppat flödesexperiment med den enkelringade versionen av GroEL, SR1, märkt med OG på en cystein som är substituerad i position 315 (se tabell S1 för en sammanfattning av hastigheter och amplituder.)
Fluorescensemissionsspektra av EL44-OG (exciterad vid 496 nm) visade att tillsats av ATP gav upphov till en stor nedgång i steady-state-fluorescensintensiteten (≈65 % i 500 μM ATP), åtföljd av en liten blå förskjutning av emissionsmaximum (fig. 1B). Däremot gav ADP en mindre minskning av intensiteten, vilket stöder att ATP:s γ-fosfat har en specifik effekt på konformationen av den 44-innehållande slingan.
Vid stoppad flödesblandning av 0,5 mM ATP med EL44-OG observerades en snabb minskning av emissionsintensiteten, med en kurva som kunde anpassas som summan av 2 exponentialer, en med en hastighetskonstant på ≈100 s-1 och en annan med en hastighetskonstant på 4 s-1 (fig. 1C). Den förstnämnda hastigheten indikerar snabb interaktion av ATP med oligandad GroEL och motsvarar hastigheter som tidigare rapporterats både för F44W (ref. 16; 80 ± 5 s-1) och för 2 andra tryptofansubstituerade versioner av GroEL: Y485W, där ett tryptofan ersattes någon annanstans i den ekvatoriala domänen (ref. 18; 123 ± 2 s-1), och R231W (ref. 17; 80 s-1), där en tryptofan ersattes i den apikala domänens kavitetsvända aspekt (GroEL saknar annars tryptofan). Som förväntat var hastigheten för interaktionen mellan ATP och EL44-OG beroende av ATP-koncentrationen (fig. 1D), och en bimolekylär hastighetskonstant på 2 × 105 M-1 s-1 bestämdes för den snabbare fasen. Den långsammare kinetiska fasen, som också är beroende av ATP-koncentrationen, motsvarar sannolikt den tredje fluorescerande fasen som observerats för GroEL:s R231W och Y485W vid ATP-bindning (17, 18). Möjligheten att denna fas återspeglade ATP-hydrolys uteslutades genom att använda ett hydrolysdefekt D398A/EL44-OG-chaperonin.
Equally Rapid Fluorescence Change on ATP Binding to Open Trans Ring of GroEL/GroES/ADP Asymmetrical Complex.
Under fysiologiska förhållanden är det normala mottagartillståndet för ATP den öppna trans-ringen i ett asymmetriskt GroEL/GroES/ADP-komplex. Med stoppad flödesblandning observerade vi att hastigheten för ATP-bindning till trans-ringen i EL44-OG/GroES/ADP-komplex liknade den till en oligandad GroEL-ring (fig. 1E, jämför med fig. 1F). Här fanns också ett ATP-koncentrationsberoende som liknade det för oligandad EL44-OG (fig. 1D).
Substratpolypeptid som är bunden till transringen påverkar inte hastigheten för ATP-bindning.
I ett antal in vitro-studier har icke-nativ polypeptid först komplexerats till den öppna transringen av ett asymmetriskt ADP GroEL/GroES-komplex före tillsats av ATP och överskott av GroES (8, 9). Under dessa förhållanden kan ATP-bindning följt av bindning av GroES tydligt kapsla in den icke-nativa polypeptiden och styra den produktiva veckningen. Påverkas ATP-bindningshastigheten i ett sådant sammanhang av det bundna substratproteinet? För att testa detta bands icke-nativ MDH till de asymmetriska EL44-OG/GroES/ADP-komplexen, och ATP tillsattes sedan med stoppad flödesblandning. Under dessa förhållanden var hastigheten för förändringen av fluorescensintensiteten praktiskt taget identisk med den för EL44-OG/GroES/ADP-komplexet i frånvaro av polypeptid (jämför fig. 1G med fig. 1E). Närvaron av ett icke-nativt substrat som är bundet till de apikala domänerna i transringen har således ingen påvisbar effekt på det snabba inträdet av ATP i de ekvatoriella nukleotidbindningsfickorna i transringen.
Snabba rörelser i de apikala domänerna åtföljer ATP-bindning.
När ATP binder snabbt till GroEL, orsakar detta en betydande justering i de apikala polypeptidbindningsdomänerna på samma snabba tidsskala, eller är de apikala förändringarna som svar på ATP-bindning relativt långsamma, så att effekterna av ATP-bindningen måste anses inträffa vid en senare tidpunkt? Den tidigare studien av R231W hade redan indikerat att apikala effekter uppstod snabbt med den mutanten (17). Även i den aktuella studien visade en fluorescerande sond på den yttre aspekten av de apikala domänerna, långt från ATP-bindningsstället på insidan av cylindern (GroEL E315C i en cystein-noll-bakgrund märkt med OG), en snabb förändring i fluorescensintensitet, på samma tidsskala som ATP-bindningen. Till exempel observerades en hastighetskonstant på 20 s-1 för ett asymmetriskt GroEL315-OG/GroES/ADP-komplex vid en ATP-koncentration på 150 μM (fig. 1H, jämför med 25 s-1 i fig. 1E). Sådana apikala förändringar skedde i samma ring som ATP är bundet till, eftersom analysen av en OG-modifierad version av E315C med en enda ring, SR315-OG, visade en liknande hastighet på förändringen av fluorescensintensiteten (Fig. 1I). Hastigheten av den apikala rörelsen var också ATP-koncentrationsberoende, där hastigheterna var parallella med hastigheterna för ATP-bindning (Fig. S2, jämför med Fig. 1D).
Relativt långsam bindning av substratpolypeptid som mätt med FRET.
För att möjliggöra en jämförelse mellan hastigheten för bindning av icke-nativ substratpolypeptid och den för bindning av ATP, mätte vi nästa gång hastigheten för bindning av substratproteiner till asymmetriska GroEL/GroES/ADP-komplex med FRET. Tre olika substratproteiner studerades: MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa) och en dubbelmutant form av maltosbindande protein (DM-MBP; 41 kDa). Alla tre proteinerna beter sig som stringenta substratproteiner vid 25 °C och kräver närvaro av GroEL, GroES och ATP för att nå nativ form (3). I deras frånvaro sker en kvantitativ aggregering. För att övervaka bindningen mättes FRET mellan substratprotein märkt med kumarinpropylmaleimid (CPM; donator) på en cysteinrest (se Material och metoder) och EL44-OG (acceptor). Genom att excitera vid excitationsmaximum för CPM (384 nm) samlades emissionsspektra in för CPM-märkta substrat (givare) medan de var bundna till omärkt GroEL (fig. 2A, DM-MBP-CPM som exempel, svart spår), för EL44-OG komplexerat med omärkt substrat (fig. 2A, acceptör märkt, blått spår), eller för komplex med CPM-märkt substrat bundet till EL44-OG (fig. 2A, rött spår). För både DM-MBP-CPM och MDH-CPM fanns det en stark donatoravstängning vid förening med EL44-OG; samtidigt uppträdde en betydande acceptorsignal.
Relativt långsam bindning av ett icke-nativt substrat, DM-MBP, till oligandad GroEL och till transringen i GroEL/GroES/ADP-komplexet. (A) Emissionsspektrum av DM-MBP märkt med CPM (donator) medan det är bundet till GroEL (D, svart spår), emissionsspektrum av EL44-OG (acceptor) medan det är komplexerat med icke-nativt DM-MBP (A, blått spår) och emissionsspektrum av komplexet DM-MBP-CPM med EL44-OG (D-A, rött spår), alla exciterade vid 384 nm, excitationsmaximum för CPM. (B) Förändring i donatorkanalens fluorescens vid stoppad flödesblandning av icke-nativ DM-MBP-CPM med EL44-OG. Blå linje representerar icke-nativ DM-MBP och D i den gula cirkeln representerar CPM-etiketten. (C) Beroende av den snabbare hastighetskonstanten för DM-MBP-bindning på GroEL-koncentrationen. Hastighetskonstanter från experiment som i B vid olika koncentrationer av GroEL (svart) eller från liknande experiment med GroEL/GroES/ADP-komplexet (rött) plottas mot GroEL-koncentrationen, vilket ger räta linjer med lutningar (andra ordningens hastighetskonstanter) på 6,11 × 106 M-1s-1 respektive 5,36 × 106 M-1s-1. (D) Förändring i donatorfluorescens vid stoppad flödesblandning av icke-nativ DM-MBP-CPM med EL44-OG/GroES/ADP-komplexet och 500 μM ATP. I flera experiment (n = 6) var hastigheten för den snabbare fasen konsekvent något snabbare för trans-ringen i närvaro av ATP än i dess frånvaro: 2,08 ± 0,11 jämfört med 1,36 ± 0,22 (tabell S2).
Vid stoppad flödesblandning av 125 nM DM-MBP-CPM med 125 nM EL44-OG observerades en minskning av donatoremissionsintensiteten, med en kurva som kunde anpassas som summan av två exponentialer, den ena med en hastighetskonstant på 1,33 s-1 och den andra med en hastighetskonstant på 0,65 s-1 (fig. 2B). Den snabbare hastigheten (k1) var beroende av koncentrationen av chaperonin (fig. 2C), men den långsammare var det inte. Vid en GroEL-koncentration på 125 nM (fig. 2B) är hastigheten för substratpolypeptidbindning (k1 = 1,33 s-1) 60 gånger långsammare än hastigheten för ATP-bindning (100 s-1 vid 500 μM ATP; fig. 1C). Även om substratbindningshastigheten skulle förutses vara flera gånger större vid den fysiologiska GroEL-koncentrationen på 1-2 μM (fig. 2C), skulle ATP-bindningshastigheten sannolikt också vara något större, med tanke på att den fysiologiska ATP-koncentrationen är flera millimolär (fig. 1D). Således är det troligt att hastigheten för ATP-ankomsten under fysiologiska förhållanden är minst 10 gånger större än substratankomsten.
I ett ytterligare test hade tillsats av ATP samtidigt med fluorescerande märkt DM-MBP en reproducerbar effekt genom att öka hastigheten för DM-MBP-bindning (fig. 2D och tabell S2). Sammanfattningsvis verkar den fysiologiska ordningen för tillsättning till en transring bestå av snabb ankomst av ATP följt av långsammare ankomst av substratprotein. Denna ordning är motsatt den som programmerats i nyligen genomförda studier, där polypeptiden inledningsvis var bunden till transringen och ATP sedan tillsattes (8, 9). Har tillsatsordningen någon mätbar effekt på omvikningen av substratproteinet? För att testa detta utförde vi experiment med ordning av tillsats och mätte återhämtningen av det nativa enzymet under i huvudsak enkelomvandlingsförhållanden.
Mer omfattande återhämtning av det nativa tillståndet när ATP tillsätts först, följt av polypeptid, jämfört med den motsatta ordningen.
Ett experiment med ordning av tillsats utfördes med hjälp av den enkelringsversionen av GroEL, SR1, vilket möjliggjorde en ”enkelomvandlings”-analys. Polypeptid som fångas av SR1 är nästan kvantitativt veckad till nativ form, efter bindning av GroES, inuti den långlivade cis-kaviteten i det stabila SR1/GroES-komplexet (10, 11). SR1 kan således inkuberas med ATP och icke-nativ polypeptid i vilken ordning som helst, följt av tillsats av GroES, och omfattningen av återhämtningen av nativt protein kan mätas i förhållande till både tillsatsordningen och intervallet mellan tillsatserna (fig. 3A). För dessa tester tillsattes GroES 2 sekunder efter ATP/polypeptid för att de första interaktionerna skulle kunna slutföras. I ett första experiment observerade vi på ett reproducerbart sätt att när icke-nativt Rubisco tillsattes först följt av ATP 2 sekunder senare, var omfattningen av Rubiscos återhämtning i nativ form endast ≈30 %. Detta jämfördes med >60 % återhämtning när ATP tillsattes först och med den ≈70 % återhämtning som observerades när ATP och GroES tillsattes till ett förbildat binärt Rubisco-SR1-komplex (framställt genom en 10-minuters inkubation av icke nativt Rubisco med SR1). Detta tyder på att i samband med en cyklingsreaktion där trans-ringen i ett acceptörkomplex GroEL/GroES/ADP är öppen och tillgänglig för att binda polypeptid under endast ≈1-2 s innan GroES binder, mobiliserar mobiliseringen av dess apikala domäner genom snabb ATP-bindning bindning, vilket gynnar bindningen av icke-nativ polypeptid. Den motsatta ordningen, tillsättning av polypeptid 2 s före ATP, verkade vara mindre gynnsam för bindning, även om ATP-mobiliserade apikala domäner därefter var tillgängliga i 2 s före GroES-tillsättning. När intervallet mellan tillsatserna av Rubisco och ATP ökades till 4 s (fig. 3A) lindrades effekten av tillsatsordningen, och kinetiken och omfattningen av återhämtningen blev nu lika stor som vid tillsats av ATP först, vilket förmodligen är en funktion av en mer omfattande polypeptidbindning under intervallet före ATP-tillsats. Även om omfattningen av återhämtningen av Rubisco i studierna av additionsordning med ett 2-s intervall påverkades avsevärt, var kinetiken för återhämtning av det ursprungliga tillståndet i de stabila SR1/GroES-komplexen likartad, vilket är förenligt med en effekt på substratproteinbindning och inte på vikningshastigheten i den inkapslade kammaren.
Bindning av ATP före icke nativ Rubisco förbättrar vikningsutbytet genom att öka omfattningen och hastigheten av bindningen. (A) Återhämtning av Rubiscoaktivitet med olika ordningsföljder för tillsättning. SR1 inkuberades med ATP i 2 eller 4 s innan icke nativt Rubisco (dRUB) tillsattes; alternativt tillsattes icke nativt Rubisco till SR1 först, följt av ATP 2 eller 4 s senare. För båda ordningarna tillsattes GroES 2 s senare, och alikvotar togs bort vid de angivna tidpunkterna för analys av Rubiscoaktivitet . Som jämförelse utfördes en ”standard” Rubisco-refolding-analys genom att SR1 inkuberades med icke-nativt Rubisco i 10 minuter innan ATP och GroES tillsattes tillsammans för att påbörja refolding (svarta symboler). (B) Bredden av bindningen av 35S-Rubisco till SR1 med olika ordningsföljder för tillsättning. Experimenten utfördes med de olika tillsatsordningarna som i A, förutom att efter tillsättning av GroES och sedan ADP-AlFx (för att stabilisera det ternära komplexet) kromatograferades blandningarna på en Superose 6-kolonn och radioaktiviteten i fraktionerna bestämdes. Den totala radioaktiviteten som återfanns vid elutionsstället för SR1/GroES/ADP-AlFx/Rubisco-komplexet rapporteras som en procentandel av den radioaktivitet som laddades på kolonnen. I identiska analyser med 4-s intervaller gav båda tillsatsordningarna ≈70 % återvinning, vilket motsvarar återvinningen av aktiviteten i A (visas inte). (C) Hastigheten för Rubiscobindning till en SR1-ring i frånvaro av ATP, mätt med FRET. Donatorfluorescens av Rubisco-CPM efter stoppad flödesblandning med en hydrolysdefekt SR1 D398A-molekyl som bär OG-fluoroforen på en substituerad Cys-44. (D) Hastigheten för Rubisco-bindning till SR398A i närvaro av ATP (tillsatt före laddning i sprutan med stoppat flöde). (E) Hastigheten av Rubiscobindning till en SR398A-ring när den tillsätts samtidigt med ATP.
Mer omfattande bindning av Rubisco när ATP tillsätts först.
För att ta itu med effekten av tillsatsordningen på substratproteinbindning använde vi 35S-märkt Rubisco och mätte den mängd som blev bunden av SR1 under inkubationerna med tillsatsordning med hjälp av gelfiltrering av slutproduktblandningarna för att separera de stabila SR1/GroES/Rubiscokomplexen från obunden polypeptid. Detta visade att ≈10 000 cpm 35S-Rubisco hade bundits när 40 000 cpm 35S-Rubisco (125 nM) tillsattes 2 sekunder före ATP och att ≈30 000 cpm hade bundits när ATP tillsattes 2 sekunder före Rubisco (Fig. 3B). Den sistnämnda bindningsgraden uppnåddes också när binära SR1-Rubisco-komplex som bildats under 10 minuter sedan inkuberades med ATP och GroES tillsammans (Fig. 3B). Dessa mätningar av substratbindningens omfattning är således parallella med omfattningen av återhämtningen av enzymatisk aktivitet (jämför fig. 3B med fig. 3A) och stöder slutsatsen att i samband med ett intervall på 2 s mellan tillsättningen av ATP/polypeptid gynnar tillsättningen av ATP initialt en effektivare substratproteinbindning.
Större hastighet av Rubiscobindning till en ATP-exponerad Chaperoninring.
Den föregående observationen av större omfattning av Rubiscobindning i ett experiment med ordning efter addition där ATP tillsätts initialt tyder på att hastigheten av Rubiscobindning med ATP-mobiliserade apikala domäner kan vara större. För att testa detta användes en ATP-hydrolysdefekt D398A-version av SR1 med OG knuten till en cystein substituerad i position 44 (i en C138A-bakgrund) för att genom FRET rapportera om bindningshastigheten för CPM-märkt Rubisco (fig. 3 C-E). Vi observerade att bindningshastigheten för Rubisco, som utfördes under samma förhållanden som de föregående additionsordningsexperimenten, var 2 gånger större i närvaro jämfört med frånvaro av ATP (jämför fig. 3D med fig. 3C). När ATP och icke-nativt Rubisco tillsattes samtidigt, vilket återspeglar den fysiologiska situationen, liknade Rubisco-bindningshastigheten den när ATP hade tillsatts före Rubisco (fig. 3E, jämför med fig. 3D). Dessa data stöder att Rubisco associerar sig snabbare med en ring vars apikala domäner har ATP-mobiliserats och att det under fysiologiska förhållanden där både ATP och icke-nativt substrat är närvarande är de ATP-mobiliserade apikala domänerna som är verksamma vid substratbindning.