Fluorescerande proteintaggar

Introduktion

Fluorescerande proteiner har använts som proteintaggar sedan mitten av 1990-talet, främst för cellbiologi och fluorescensmikroskopi. Dessa taggar har inte bara revolutionerat cellbiologin genom att göra det möjligt att avbilda nästan alla proteiner, utan de används också i biokemiska tillämpningar. Ett viktigt exempel är immunutfällning och affinitetsrening av FP-märkta proteiner, vilket möjliggjordes genom utvecklingen av affinitetshartser med hög avkastning, renhet och affinitet, t.ex. ChromoTeks Nano-Traps (https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/).

I den här bloggen ger vi en genomgång av

• gröna fluorescerande proteiner
• röda fluorescerande proteiner
• selvmärkande proteiner, som kräver kovalent koppling av en fluorescerande molekyl

Typer av fluorescerande proteiner

De flesta forskare använder sig av de intrinsiskt fluorescerande proteinerna GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP eller mCherry. Alternativt har extrinskt fluorescerande eller självmärkande proteiner införts som kräver kovalent koppling av en fluorescerande molekyl till det icke-fluorescerande proteinet, t.ex. proteintaggarna SNAP, CLIP och Halo. Dessa självmärkande fluorescerande proteiner har vissa prestandafördelar jämfört med intrinsikala FPs på grund av deras fluorescerande färgämnes egenskaper.

Figur 1: Strukturer av fluorescerande proteiner.

(A) Intrinsikt fluorescerande proteiner (FP) som EGFP, GFP, RFP, mNeonGreen, turboGFP etc. har endast ett litet antal gemensamma rester, men viker sig alla i en bevarad β-tunnestruktur. Deras fluorescens uppkommer genom cyklisering av ryggraden och oxidering av tre aminosyrarester i mitten av denna tunna (markerad till höger), vilket resulterar i en kromofor med två ringar. Denna kemiska process beskrivs som kromoforens mognad, är inneboende i proteinvecket och beror endast på miljövariabler som temperatur och syrekoncentration, men inte på ytterligare enzymer. Färgen, fotostabiliteten, kvantutbytet och andra spektrala egenskaper hos intrinsikaliskt fluorescerande proteiner är ett resultat av mutationer i de aminosyror som utgör kromoforen eller som är belägna i kromoforens närhet.

(B) Extrinsikaliskt fluorescerande proteiner, t.ex. HaloTag, är icke-fluorescerande i sin basala apo-form. Endast om en lämplig aktiverad fluorofor tillsätts till HaloTag-proteinet kommer denna fluorofor att fångas in och bindas kovalent till HaloTag-resten D106, vilket gör HaloTag fluorescerande. (PDB ID för strukturer: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)

Grönt fluorescerande protein (GFP) från maneter och dess derivat är fortfarande de mest frekventa fluorescerande proteinerna inom biomedicinsk forskning. Nyligen har ytterligare gröna fluorescerande proteiner introducerats som härrör från andra organismer. Dessa lysande fluorescerande proteiner har samma grundveck som GFP men skiljer sig mycket åt på sekvensnivå. De kräver därför nya, särskilda forskningsverktyg, t.ex. antikroppar.

Originalet: GFP

Grönt fluorescerande protein isolerades först från maneten Aequorea victoria 1962 av Osamu Shimomura. Det har en grön fluorescens med lång Stokes-förskjutning (ex 395 nm; em 509 nm). 30 år senare lyckades Douglas Prasher till slut klona GFP-sekvensen och Martin Chalfie uttryckte denna sekvens in vivo. Senare utvecklade Roger Tsiens labb GFP till en uppsättning veritabla forskningsverktyg. Shimomura, Chalfie och Tsien tilldelades Nobelpriset 2008. Se Roger Tsiens Nobelprisföreläsning här: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.

Forskarna har utvecklat en mängd GFP-varianter med olika egenskaper. Dessa FP har olika funktionella och spektrala egenskaper. Den första betydande förbättringen av GFP var en mutation (S65T) som ökade fluorescenssignalens intensitet och stabilitet. Den huvudsakliga excitationstoppen har förskjutits till 488 nm (Heim et al., 1995). Den vanliga varianten EGFP är en konstruerad version av GFP, vilket underlättar den praktiska användningen av GFP i en mängd olika organismer och celler.

Grönt fluorescerande protein GFP är också känt som avGFP, wtGFP och gfp10; EGFP som enhanced GFP och GFPmut1.

https://www.fpbase.org/protein/avgfp/

https://www.fpbase.org/protein/egfp/

TurboGFP

TurboGFP rapporterades 2004 och är ett snabbt mognande och ljust dimeriskt grönt fluorescerande protein som härstammar från CopGFP från copepoden Pontellina plumata. Copepod TurboGFP ligger evolutionärt långt ifrån fluorescerande proteiner som härstammar från maneter, t.ex. EGFP, och delar endast ca 20 % sekvensidentitet med de vanligen använda GFP-varianterna. Därför binder de flesta anti-GFP-antikroppar, inklusive GFP-Nanobody som används i GFP-Trap, inte till TurboGFP.

https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/

mNeonGreen

mNeonGreen härstammar från ett multimeriskt gult fluorescensprotein från lanslöparen Branchiostoma lanceolatum. Därför är mNeonGreen evolutionärt avlägset från FP som härstammar från maneter. mNeonGreen och vanliga GFP-derivat delar bara ca 20 % sekvensidentitet. På grund av den låga sekvenslikheten förväntas affinitetsverktyg (dvs. antikroppar) för GFP-varianter inte binda till mNeonGreen. Detta har förvisso visats för ChromoTeks affinitetsreagenser (anti-GFP Nanobodies/ VHHs och antikroppar).

Första gången publicerad 2013 är mNeonGreen upp till tre gånger ljusare än GFP. Det är ett framväxande, monomeriskt mångsidigt grönt/gult fluorescerande protein för avbildningstillämpningar, inklusive superupplösande mikroskopi. Dessutom fungerar mNeonGreen som acceptör för cyan fluorescerande proteiner i FRET-tillämpningar (fluorescence resonance energy transfer). Det verkar vara det ljusaste monomera gröna fluorescerande proteinet som är känt hittills och har en snabb mognadshastighet.

https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/

Genomgång av GFP, TurboGFP, och mNeonGreen

Egenskaper	EGFP (det mest använda GFP-derivatet)	turboGFP	mNeonGreen
Fyndighet/ Första publikation
Origin	GFP från manet Aequorea victoria	CopGFP från copepoden Pontellina plumata	multimeric yellow fluorescent protein from lancelet Branchiostoma lanceolatum
Matureringshastighet (vid 37°C)	25 min	25 min	10 min
Sekvensidentitet med EGFP	(100 %)	~20 %	~20 %
Avledd från GFP?	Ja	Nej	Nej
Struktur	Svagt dimer	Dimer	Monomer
	Gemensamma varianter	AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, monomer eGFP A206K, CFP, eCFP, mCerulean, YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet, BFP	TurboGFP, CopGFP	mNeonGreen
Excitation/emissionsmaximum	488 nm/ 509 nm	482 nm/ 502 nm	506 nm/ 517 nm
	Längd/ molekylvikt (MW)	239 aminosyror, 26.9 kDa	2x 232 aminosyror, 2x 26 kDa	237 aminosyror, 26,6 kDa
Forskningsverktyg som erbjuds av ChromoTek	Immunoprecipitation: GFP-Trap Immunofluorescens: GFP-Booster, Kanin anti-GFP-antikropp PABG1 Western blot: Råttan anti-GFP-antikropp Kontroll: renat EGFP-protein	Immunoprecipitation: TurboGFP-Trap	Immunoprecipitation: mNeonGreen-Trap Immunofluorescens: Mus anti-mNeonGreen-antikropp Western blot: Mouse anti-mNeonGreen antibody

Röda fluorescerande proteiner (RFP:s) är FP:er som avger röd-orange fluorescerande ljus. Det första RFP som blev kommersiellt tillgängligt var DsRed. Det härstammade från Discosoma sp. havsanemoner 1999.

DsRed har vissa immanenta praktiska problem: (i) Den har en mognadstid på cirka 24 timmar, vilket gör den oanvändbar för kortvariga experiment. (ii) Den tetrameriska formen av DsRed kan äventyra funktionen hos de proteiner som den är knuten till. (iii) Dess fotostabilitet är ganska låg.

Som en följd av detta utsattes DsRed för platsriktad mutagenes för att bli allmänt användbar som en genetiskt kodad fusionstag. Så småningom skapades monomera RFP-derivat med bättre fluorescerande prestanda (när det gäller ljusstyrka och fotostabilitet) och högre mognadseffektivitet. Dessutom skapades derivat med orange, röd och mycket röd fluorescens. Dessa monomeriserade versioner av RFP blev de värdefulla forskningsverktygen mCherry, mOrange, mRaspberry, mPlum (även kallade ”mFruits”), mKO, mRFP (även kallad mFruits), mKO, mRFP (även kallad mRFP) och mCherry. mRFP1), mRFPruby, mRuby, tagRFP, mKate2 och DsRed-Express etc.

Utvidare RFP identifierades i andra antozoer (dvs. anemoner och koraller), men även dessa proteiner var oftast tetramerer. De har således inte optimerats ytterligare för användning inom forskningen ännu.

mRFP (även kallat mRFP1)

Den första monomera varianten av dsRed, som genmodifierades i Roger Tsiens labb, benämndes helt enkelt mRFP (eller mRFP1), dvs. monomeric red fluorescent protein. Jämfört med dsRed kännetecknas mRFP1 av något lägre nivåer av absorption, kvantutbyte och fotostabilitet. Dess mognadshastighet är dock cirka 10 gånger snabbare än för dsRed, vilket resulterar i en liknande effektiv ljusstyrka när det uttrycks i levande celler.

https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/

mCherry

mCherry är troligen den mest använda RFP-varianten. Det är ett monomeriskt rött fluorescerande protein med bred användbarhet som fusionsprotein i olika celltyper. Liksom andra mFruit RFP:er härstammar mCherry från dsRed-varianten mRFP1 via riktad evolution av Roger Tsiens labb. Jämfört med andra mFruits har mCherry den högsta fotostabiliteten, den snabbaste mognadshastigheten och en utmärkt pH-resistens. Den har dock ett lägre kvantutbyte än mRFP1.

https://www.fpbase.org/protein/mcherry/

mPlum

Roger Tsiens labb har också genererat ett långt rött monomeriskt derivat av mRFP1/dsRed, kallat mPlum. Fjärrröda FPs är fördelaktiga för tillämpningar för helkroppsavbildning eftersom de viktigaste vävnadsabsorbenterna, t.ex. vatten, lipider och hemoglobin, är nästan transparenta i emissionsområdet 650-900 nm. Liksom de flesta rödförskjutna RFP:er har mPlum en förlängd Stokes-förskjutning.

https://www.fpbase.org/protein/mplum/

Variation av mCherry, mRFP (mRFP1), och mPlum

Egenskaper	mCherry	mRFP (mRFP1)	mPlum
Fynd/ första publicering
Origin	DsRed från havsanemon Discosoma sp.	DsRöd från havsanemon Discosoma sp.	DsRöd från havsanemon Discosoma sp.
Matureringshastighet (vid 37°C)	15 min	60 min	100 min
Struktur	Monomer	Monomer	Monomer
Aggregering	noll	noll	noll
Excitation/emissionsmaximum	587 nm/ 610 nm	584 nm/ 607 nm	590 nm/ 649 nm
Längd/ molekylvikt (MW)	236 aminosyror, 26.7 kDa	228 aminosyror, 25,4 kDa	229 aminosyror, 25,6 kDa
Forskningsverktyg tillhandahållna av ChromoTek	Immunoprecipitation: RFP-Trap Immunofluorescens: RFP-Booster, Råttan anti-RFP-antikropp Western blotting: RFP-Booster, Rat anti-RFP-antikropp Western blotting: Mus anti-RFP-antikropp	Immunoprecipitation: RFP-Trap Immunofluorescens: RFP-Booster, antikropp mot Råtta anti-RFP Western blotting: RFP-Booster, Råtta anti-RFP-antikropp Western blotting: Mus anti-RFP-antikropp	Immunoprecipitation: RFP-Trap Immunofluorescens: RFP-Booster, antikropp mot Råtta anti-RFP Western blotting: RFP-Booster, Råtta anti-RFP-antikropp Western blotting: Mus anti-RFP-antikropp

De extrinsiskt fluorescerande proteintaggarna Halo, SNAP och CLIP kräver kovalent infångning av en liten fluorescerande ligand för att omvandlas till ett fluorescerande protein. För detta ändamål härstammar dessa självmarkerande proteintaggar från enzymer som katalyserar bildandet av kemiska bindningar: SNAP- och CLIP-taggarna är varianter av O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferas som reagerar med bensylguanin- respektive bensylcytosinderivat. HaloTag är härledd från ett haloalkan-dehalogenas och reagerar med alkylhalogenider (figur 1).

I allmänhet är både intrinsikaliskt och extrinsikaliskt fluorescerande proteiner fusionerade till ett intressant protein för att möjliggöra cellulär avbildning och detektion av det. Extrinskt fluorescerande proteiner kräver dock att en reaktiv fluorofor tillsätts, vilket har flera fördelar:

• Högre kvantutbyte och fotostabilitet
• Stark fluorescens i både levande och fixerade celler
• Ett bredare urval av fluorescerande färgämnen
• En enda genetisk konstruktion gör det möjligt att välja olika fluoroforer för flerfärg. avbildning/multiplexering
• Fluorescens initieras endast vid tillsats av etiketten

Förmågan att tillhandahålla tre extrinsiskt fluorescerande proteiner med olika substrat/ligandspecificiteter gör det möjligt att använda dem ortogonalt i multiplexexperiment, även i kombination med intrinsikaliskt fluorescerande FPs.

Avhängigt av de experimentella behoven kan man använda cellpermeanta ligander baserade på tetrametylrhodamin (TMR), Oregon Green, diAcFAM eller kumarin, som lätt korsar cellmembranet för märkning av intracellulära proteiner. Alternativt kan cellimpermeanta ligander baserade på impermeabla fluorophorer som Alexa Fluor® 488 och 660 användas för snabb märkning av cellytan.

Sammanställning av HaloTag, SNAP-Tag, och CLIP-Tag

.

Property	HaloTag	SNAP-Tag	CLIP-Tag
Fynd/ första publikation
Origin	Haloalkan dehalogenas från Rhodococcus rhodochrous	human O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferas	human O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferas
Struktur	Monomer	Monomer	Monomer	Monomer
Reaktivitet	Khloralkanderivat	O6-bensylguaninderivat	Benzylcytosinderivat
Ligander	Cellpermeabla eller icke-permeabla färgämnen, fluorophorer, biotin och pärlor	Cellpermeabla eller icke-permeabla färgämnen, fluorophorer, biotin och pärlor	Cellpermeabla eller icke-permeabla färgämnen, fluorophorer, biotin, och pärlor
Excitation/emissionsmaximum	Beror på kopplad fluorofor	Beror på kopplad fluorofor	Beror på kopplad fluorofor	Beroende på kopplad fluorofor
Längd/molekylvikt (MW)	297 aminosyror, 33.6 kDa	182 aminosyror, 19,4 kDa	182 aminosyror, 19,4 kDa
Forskningsverktyg som erbjuds av ChromoTek	Immunoprecipitation: Halo-Trap Western blotting: mus anti-HaloTag-antikropp	Immunutfällning: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: antikropp mot SNAP/CLIP-tag® från råtta	Immunutfällning: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: råtta anti-SNAP/CLIP-tag® antikropp

HaloTag

Den självmärkta HaloTag har härletts från haloalkan dehalogenasenzymet DhaA från Rhodococcus rhodochrous. Dess aktiva plats har modifierats genetiskt för att irreversibelt binda kloroalkanlänkersubstrat. På grund av denna typ av självmordshämning är det inte längre möjligt att regenerera den katalytiska platsen för ytterligare dehalogenering. Beroende på det valda substratet omvandlas HaloTag till en fluorescerande proteintagg eller kan t.ex. immobiliseras på agarospärlor.

Då haloalkan-dehalogenaser saknas i eukaryota celler och de flesta prokaryoter, inklusive E. coli, kommer det inte att förekomma någon bakgrundsmärkning.

SNAP-tag

Den självmärkande proteintaggen SNAP-tag härstammar från det humana O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferaset (hATG), som i egenskap av vildtypprotein avlägsnar alkyleringsskador från DNA. Den resulterande hAGT-varianten som används som SNAP-tag reagerar kovalent med O6-benzylguaninderivat (dvs. en fluorescerande märkning som är konjugerad till guanin- eller kloropyrimidinavgångsgrupper via en bensylbindare) på ett irreversibelt och mycket specifikt sätt. I märkningsreaktionen är substratets substituerade bensylgrupp kovalent bunden till SNAP-tag.

CLIP-tag

CLIP-tag är en modifierad version av SNAP-tag, konstruerad för att reagera med bensylcytosin i stället för bensylguaninderivat. När CLIP-tag används tillsammans med SNAP-tag möjliggör CLIP-tag ortogonal och komplementär märkning av två proteiner samtidigt i samma cell.

En guide för att välja fluorescerande proteiner
Shaner N.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. (2005)
Nature Methods 2(12), 905-909 doi: 10.1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf

Grönt fluorescerande protein:
Det grönt fluorescerande proteinet
Tsien R.Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.

Förbättrad grön fluorescens
Heim, R., Cubitt A.B. and Tsien R.Y. (1995)
Nature, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0

Strukturell grund för den snabba mognaden av Arthropoda grönt fluorescerande protein
Evdokimov A.G., Pokross M.E., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A. och Chudakov D.M. (2006)
EMBO reports, 7(10), 1006-1012. doi: 10.1038/sj.embor.7400787.

Ett ljust monomeriskt grönt fluorescerande protein från Branchiostoma lanceolatum
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J. Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M, Davidson M.W. och Wang J. (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409. doi: 10.1038/nmeth.2413

Röda fluorescerande proteiner:

Förbättrade monomera röda, orange och gula fluorescerande proteiner som härrör från Discosoma sp. röd fluorescerande protein
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E. and Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037

Ett monomeriskt rött fluorescerande protein
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. and Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699

Evolution av nya proteiner som inte är antikroppsproteiner via iterativ somatisk hypermutation
Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.

Rekonstruera bristande mognadsgrad hos kromoforer för rött fluorescerande protein genom rationell design
Moore M.M., Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. and Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463. doi: 10.1371/journal.pone.0052463.

Halo, SNAP och CLIP:

Releasable SNAP-tag Probes for Studying Endocytosis and Recycling
Cole N.B. and Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.1021/cb2004252

Site-Specific Protein Labeling with SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Current protocols in protein science / editorial board, Coligan J.E. et al, 73: 30.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73

En konstruerad proteintagg för multiproteinmärkning i levande celler
Gautier A., Juillerat A., Heinis C., Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. och Johnsson K. (2008)
Chemistry and Biology 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007

HaloTag: En ny teknik för märkning av proteiner för bildbehandling av celler och proteinanalys
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R, Friedman-Ohana R, Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. och Wood K.V. (2008)
ACS Chem. Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k

En allmän metod för kovalent märkning av fusionsproteiner med små molekyler in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. och Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.103838/nbt765

Fluorescerande märkning av COS-7 som uttrycker SNAP-tag-fusionsproteiner för avbildning av levande celler
Provost C.R. och Sun L. (2010)
Visualized Exp. 39: 1876, doi: 10.3791/1876

Enbart för forskningsändamål.

ChromoTeks produkter och teknik omfattas av beviljade patent och pågående ansökningar som ägs av eller är tillgängliga för ChromoTek GmbH genom exklusiv licens.

ChromoTek, Chromobody, F2H, GFP-Trap, Myc-Trap, RFP-Trap, Spot-Tag, Spot-Label och Spot-Trap är registrerade varumärken som tillhör ChromoTek GmbH. SNAP-tag är ett registrerat varumärke och CLIP-tag är ett varumärke som tillhör New England Biolabs, Inc. Nanobody är ett registrerat varumärke som tillhör Ablynx, ett företag inom Sanofi. Andra leverantörers produkter kan vara varumärken eller registrerade varumärken som tillhör respektive leverantör. Uttalanden om andra leverantörers produkter lämnas enligt vår bästa kunskap.