En kritisk roll för CD29 och CD49f vid förmedling av metastasering för cancerinitierande celler isolerade från Brca1-associerad musmodell av bröstcancer

CSCs i Brca1-muterade cancerceller förmedlar cellmigration in vitro

Vi har tidigare isolerat CD24+CD29+-celler och CD24+CD49f+-celler som är berikade för cancerinitierande celler eller CSCs från primära brösttumörer utvecklade i Brca1-muterade möss eller från en odlad cellinje, (W0069), som härstammar från en Brca1-mammatumör.39 För att testa dessa cellers roll i metastasering sorterade vi CD24+CD29+-celler (ska kallas CSC) och CD24-CD29-celler (icke-CSC) från cellinjen W0069 som innehåller cirka 15 % CD24+CD29+-celler som tidigare visats,39 och vi undersökte migrationsförmågan med hjälp av både sårläkning och transwell-analyser. Efter 24 timmar uppvisade CD24/CD29 dubbelpositiva celler bättre migrationsförmåga jämfört med de dubbelnegativa cellerna, vilket framgick av sårstorleken (figur 1a). Transwell-migrationsanalysen visade också en signifikant skillnad i antalet migrerade celler både på filterets bottenyta (175,6±19 vs 54,2±18,1, **P<0,01) och den nedre kammaren i transwell (82,3±5,5 vs 4,3±2,1 kolonier, **P<0,01) (figur 1b). Liknande resultat erhölls när vi undersökte olika subkloner som härstammade från samma cellinje, antingen positiva eller negativa för förekomst av CSC:er (data visas inte). För att bekräfta att CSC:er har ökad motilitet blandade vi olika mängder W0069-celler med dubbelnegativa celler som sorterats från cellinjen W0069. Som framgår av figur 1c minskade migrationsförmågan när antalet dubbelpositiva celler minskade, även om det totala antalet använda celler förblev stabilt genom att öka antalet CD24-CD29-celler. Genom att börja med 5 × 104 W0069-celler fann vi att migrerade celler bildade 52,6±15,5 kolonier i den nedre kammaren. När 4 × 104 W0069-celler blandades med 1 × 104 dubbelnegativa celler minskade antalet kolonier till 16±2,6. Antalet kolonier minskade ytterligare när vi fortsatte att minska antalet W0069-celler och öka antalet CD24-CD29-celler (figur 1c). Samma resultat erhölls när W0069-celler blandades med en subklon (W0069-202), som endast har CD24-CD29-celler (kompletterande figur 1a och b). Omvänt visade vi att antalet kolonier ökade när antalet CD24+CD29+-celler som användes ökades gradvis (kompletterande figur S1c). För att ytterligare verifiera CSC:s roll i migrationen användes W0069-grönt fluorescerande protein-märkta celler, positiva för förekomst av CSC:s, som blandades med sorterade icke-märkta CD24-CD29-celler som inte var märkta. Genom att öka antalet positiva celler noterade vi en ökning av antalet kolonier som bildades av de migrerade cellerna, och alla kolonier som bildades var gröna när de kontrollerades i ett fluorescensmikroskop, vilket innebär att migration kan ses endast när CD24+CD29+-celler finns i cellkulturen (figur 1d och e). Tillsammans tyder dessa data på att CSCs uppvisar ökad motilitet i Brca1-muterade cancercellinjer.

CSCs i Brca1-muterad cancer förmedlar cancermetastasering in vivo

Nästan utvärderade vi CSCs potentiella roll i metastasering in vivo. Färskt sorterade CD24+CD29+ och CD24-CD29- celler samt subkloner positiva eller negativa för samma markörer från cellinjen W0069 implanterades i bröstkörteln hos 6-8 veckor gamla jungfruliga athymiska (naken) möss. Först noterade vi att tumörtillväxten var långsammare när sorterade CD24-CD29-celler jämfördes med CD24+CD29+-celler (figur 2a och b), vilket stämmer överens med en föreställning om att denna population anrikas för CSC.39 Liknande resultat uppnåddes när subkloner som antingen var positiva eller negativa för förekomst av CSC användes (data visas inte). Även om möss som injicerats med CD24+CD29+-celler måste avlivas tidigare (dag 49-54) än möss som injicerats med CD24-CD29-celler (dag 60-69) på grund av större tumörbörda, fanns det en signifikant ökning av förekomsten av metastaser i gruppen av möss som injicerats med CD24+CD29+-celler. Särskilt 3/15 möss som implanterats med negativa cellinjer hade en liten tumörknöl i lungan per mus (figur 2c och d). Däremot visade sig 13/18 möss som implanterats med positiva cellinjer ha metastatiska knölar i lungorna med sammanlagt över 100 knölar (detta antal kan vara underskattat eftersom storleken på de flesta knölarna var mycket större och knölarna inte kunde räknas exakt när det fanns för många i en lunga) (figur 2c och d). Eftersom det fanns ungefär en sjufaldig (5000mm3/700mm3) skillnad i primärtumörstorlek mellan de positiva och negativa tumörerna hade vi övervägt en möjlighet att skillnaden i metastasering kan tillskrivas skillnaden i tumörtillväxt. Det är dock känt att tumörmetastasering startar i inledande stadier när tumörerna är små snarare än i sena stadier när de är stora,40 vilket talar emot denna möjlighet. Dessutom är skillnaden i nodulantal ungefär 33 gånger större (100/3) och de flesta noduler som härrör från dubbelpositiva celler är mycket större än de som härrör från dubbelnegativa celler, vilket belyser de två subpopulationernas olika metastatiska förmåga. När det gäller ursprunget till de tre metastatiska nodulerna är det möjligt att den dubbelnegativa populationen fortfarande kan innehålla vissa celler som har lägre cancerinitierande och metastatisk förmåga. Alternativt kan vissa CD24-CD29-celler få dessa förmågor genom de-differentiering. Detta är intressanta frågor som förtjänar ytterligare undersökningar.

CD29 och CD49f har en kritisk roll för att förmedla cancermetastasering

Interessant nog visade profilering av dessa metastatiska tumörer genom fluorescensaktiverad cellsorteringsanalys med hjälp av CD24- och CD29-markörer att de som kom från de dubbelt positiva cellinjerna hade en liknande profil som de primära tumörerna eller den ursprungliga cancercellinjen (figur 3a, vänster). Eftersom endast CSC inom tumören kan återskapa den ursprungliga tumörheterogeniteten tyder detta på att CSC metastaserar och driver bildandet av de metastatiska tumörerna. Däremot upptäcktes inga CD24- och CD29-dubbelpositiva celler i de tumörer som härrörde från de negativa cellinjerna även efter att de metastaserat (figur 3a, höger), vilket framgick av fluorescensaktiverad cellsorteringsanalys. Dessutom kunde vi upptäcka CD24+CD29+-celler genom immunofluorescensfärgning i metastatiska noduler i lungor från tumörer som initierats genom implantation med CD24+CD29+-celler (figur 3b), men inte från tumörer som initierats genom implantation med CD24-CD29-celler (data visas inte). I överensstämmelse med observationen att CD24+CD29+-celler har högre rörlighet än CD24-CD29-celler, upptäcktes vid färgning med antikroppar mot CD24 och CD29 även CD24+CD29+-celler i migrerande celler under sårläkningsanalysen (figur 3c). Dessa resultat stödjer idén att CSCs uppvisar ökad motilitet både in vitro och in vivo och har en avgörande roll för att driva den metastatiska förmågan hos Brca1-muterade brösttumörer.

Både CD29 (β1-integrin) och CD49f (α6-integrin) är integrin-underenheter som fungerar som receptorer för extracellulär matris.41 Eftersom extracellulär matris är involverad i cellrörlighet och cancermetastasering41 var vi intresserade av att fastställa om CD29 och CD49f endast tjänar som markörer för CSC eller om de faktiskt har en kritisk roll för att förmedla cancermetastasering. Vi slog först ner CD29 i W0069- och CD24+CD29+-celler med hjälp av ett individuellt små interfererande RNA (siRNA) som är riktat mot CD29:s öppna läsram, och våra data avslöjade en anmärkningsvärd, men inte statistiskt minskad cellmigration hos siCD29-celler jämfört med kontrollceller (figur 4a och b). Eftersom CD29 och CD49f bildar heterodimerer misstänkte vi att CD49f skulle kunna kompensera vissa funktioner när CD29-uttrycket var nedsatt. För att undersöka detta slog vi därefter ut CD49f med siRNA i dessa celler (figur 4a). Våra data visade att knockdown av enbart CD49f också minskade cellmigrationsförmågan något till liknande nivåer som observerades i siCD29-behandlade celler (figur 4b). En markant minskning av cellmigrationen, men inte av cellens livskraft, observerades dock när båda slogs ut samtidigt (figur 4a-d). Samma resultat erhölls genom att använda en pool av siRNA mot fyra olika regioner i den öppna läsramen för dessa gener (kompletterande figur 2a-c). Vi har också kontrollerat uttrycket av fyra besläktade integriner (integrin α5 och 7 samt integrin β2 och 3) efter att ha slagit ut CD29 och CD49f, och data tyder på att dessa siRNA inte förändrade uttrycket av andra integriner, vilket utesluter korshämmande aktivitet av dessa siRNA mot andra integriner (kompletterande figur 2d). Sammantaget antyder dessa resultat att integrinerna α6 och β1 kan ha en överlappande, men kritisk funktionell roll i CSC:s migration. Genom att sortera cellerna med integrin α6 och β1 som markörer berikar vi alltså faktiskt de celler där dessa proteiner kan ha en funktionell roll för att förmedla cellmigration in vitro och cancermetastasering in vivo.

CSCs uppvisade epitelial to mesenchymal transition signature gene expression

För att förstå den mekanism som ligger till grund för CSCs förbättrade metastatiska förmåga utförde vi morfologiska och molekylära analyser på både CD24+CD29+ och CD24-CD29- celler. Vår analys visade att CD24-CD29-cellerna uppvisade mer framträdande membranbundet E-cadherin, en markör för epitelceller, än CD24+CD29+-celler (figur 4e). qRT-PCR-analysen påvisade också högre uttrycksnivåer av E-cadherin i CD24-CD29-celler än CD24+CD29+-celler (figur 4f). I överensstämmelse med de minskade uttrycksnivåerna av E-cadherin uppvisade CD24+CD29+-celler också högre uttrycksnivåer av flera markörgener för mesenkymala celler, vilket avslöjades genom qRT-PCR (figur 4f) och western blot-analys (kompletterande figur 2e). Eftersom båda celltyperna härstammar från ett duktalt bröstcancer, tyder den ökade mesenkymala egenskapen hos CD24+CD29+-cellerna på att de har genomgått en övergång från epitel till mesenkym, vilket ger en molekylär grund för deras ökade rörlighet in vitro och cancermetastasering in vivo.

Sammanfattningsvis har vi studerat den metastatiska potentialen hos CSCs som är berikade i CD24+CD29+-cellpopulationen som isolerats från en Brca1-muterad musmodell av bröstcancer, och våra data indikerade att CSCs uppvisade en mycket högre migrationsförmåga än icke-CSCs i vävnadskultur och en ökad metastatisk potential i allograft-nude möss. Vi visade att CD24+CD29+-celler bibehöll en förmåga att differentiera och återskapa heterogenitet i de metastatiska tumörerna, medan CD24-CD29-celler inte kunde göra det. Ett mycket intressant resultat är dock att CD29 och CD49f, som har använts som markörer för att isolera CSC från mammatumörer hos mus, 39, 42, 43 har en överlappande, men ändå kritisk roll för att förmedla CSC:s migration. Hos möss utgör β1-integrin det dominerande uttryckta integrinet i bröstepitelceller och har en kritisk roll i cancerprogressionen.44 Medan α6-integrin i humana bröstcancerformer uttrycks i höga nivåer och fungerar som en oberoende prognostisk faktor, vilket avslöjades i en studie med en tidsberoende effekt som begränsades till de första två årens uppföljning.45 Ändå förblir den potentiella rollen för båda generna i CSC:er i bröstcancer svårfångad. Våra data visade att nedsatt funktion av β1-integrin eller α6-integrin enbart resulterar i en mycket mildare effekt än att slå ut båda generna samtidigt. Detta resultat stämmer överens med det faktum att båda integrinerna kan para ihop sig med varandra för att bilda heterodimerer för extracellulära matriskomponenter som fibronectin och laminin.41, 46, 47, 48, 49 Det har föreslagits att ett malignt socialt nätverk medierar cellcellsadhesion och kommunikation mellan CSC:er och deras mikromiljö.20, 21 Vår studie implicerar en viktig roll för β1/α6-integriner i medieringen av detta nätverk. Specifikt kan β1/α6-integriner förmedla interaktion mellan CSC och stroma och vidarebefordra signalering från den extracellulära matrisen till det cellulära maskineriet, vilket leder till ökad aktivitet hos CSC:er när det gäller livskraft, differentiering och metastasering.