Abstract
Disackaridaser (DS) är enzymer som är inbäddade i tunntarmens enterocyters mikrovillösa membran. Vid obehandlad celiaki (CD) ses en allmän minskning av DS-aktiviteterna. I detta manuskript granskas olika aspekter av DS-aktiviteterna vid sjukdomen: deras användbarhet vid diagnos och deras tillämpning vid in vitro-toxicitetstestning. Det senare har aldrig etablerats inom CD-forskningen. Med de senaste framstegen inom tekniken för organoidteknik i tunntarmen kan dock DS användas som en biomarkör för in vitro-studier. Detta inbegriper etablering av självförnyande epitelceller som tas fram från vävnad och som uttrycker differentieringsmarkörer, inklusive borstgränsenzymerna. Bestämning av DS-aktiviteter i duodenum kan ge ytterligare information vid diagnostisering av CD: (i) kvantifiera svårighetsgraden av de observerade histologiska lesionerna, (ii) ge prediktiva värden för graden av mukosal villusatrofi och (iii) underlätta diagnosen av CD när mindre histologiska förändringar ses. DS kan också ge ytterligare information för att bedöma svaret på en glutenfri diet eftersom en markant ökning av deras aktiviteter sker fyra veckor efter det att de börjat med den. Olika endogena och exogena faktorer som påverkar DS kan också vara relevanta när man överväger att utreda DS roll vid andra tillstånd, inklusive icke celiakisk glutenkänslighet och DS-brist.
1. Introduktion
I vissa individer är gastrointestinala symtom inklusive diarré relaterade till intag av vissa former av kolhydrater i kosten. Symtomen kan hänföras till en eller flera enzymbrister i tunntarmsslemhinnan som hydrolyserar disackarider . Dessa inkluderar laktasbrist (medfödd och vuxen typ), sucrase-isomaltasbrist, maltas-glukoamylasbrist och trehalasbrist. Med undantag för laktasbrist hos vuxna är de andra ovan nämnda bristerna relativt sällsynta . Andra tillstånd, inklusive celiaki (CD), som leder till skador i tunntarmen kan leda till minskad disaccharidasaktivitet (DS). Det har också föreslagits att sekundära DS-brister eventuellt kan förklara symtom hos patienter med CD som har intakta villi .
Laktos som spjälkas av borstgränsenzymet laktas är en av de dåligt absorberade kortkedjiga kolhydrater som ofta kallas FODMAPs (fermenterbara, oligo-, di-, monosackarider och polyoler). Det har visats att ett minskat FODMAP-intag förbättrar gastrointestinala symtom hos patienter med icke celiakisk glutenkänslighet (NCGS) . Det har visats att andra komponenter än gluten i vete kan ha betydelse för NCGS, nämligen amylas-trypsinhämmare . Bristen på biomarkörer för detta tillstånd kan få forskarna att undersöka den potentiella rollen för borstgränsenzymer som laktas.
I obehandlad CD ses en allmän minskning av DS-aktiviteter . Innan serologiska tester infördes var DS-aktiviteterna i tunntarmen viktiga laboratorieparametrar för att underlätta diagnosen av CD. Bestämning av individuell DS-aktivitet har också varit avgörande för differentialdiagnosen av medfödda metaboliska störningar. Mätning av deras aktivitet hjälper till att skilja mellan primära och sekundära DS-brister . Primära typer av DS-brister utgör ”medfödda fel i ämnesomsättningen” av ett specifikt enzym . Ett exempel på detta är medfödd laktasbrist, där det finns normala nivåer av maltas och sukras med reducerat laktas. CD är en sekundär DS-brist eftersom alla DS är reducerade på grund av gluteninducerad skada på tunntarmsslemhinnan .
En markant ökning av DS-aktiviteterna inträffar fyra veckor efter det att man börjat med en glutenfri diet (GFD), men aktiviteterna reduceras återigen om celiakipatienterna återgår till en normal diet . Hos patienter med behandlad CD ger intraduodenal instillation av gluten karakteristiska histologiska förändringar och en därmed förknippad markant minskning av disackaridasaktiviteterna inom 3,5 timmar . Minskningen av DS-aktiviteterna korrelerar med biopsiens histologiska grad, vilket innebär att DS skulle kunna användas som en biomarkör för CD.
Detta manuskript granskar olika aspekter av DS-aktiviteterna vid CD: deras användbarhet i diagnosen och deras tillämpning vid in vitro-toxicitetstestning. Dessutom beskriver vi de senaste framstegen inom tekniker för organoidteknik för tunntarm, inklusive kokultur med immunceller, som erbjuder en spännande möjlighet att utveckla toppmoderna in vitro-modeller för CD-forskning. I denna modell skulle enzymer vid borstgränsen kunna användas som markörer för CD-patogenes
2. Diagnostiska aspekter av småintestinal disackaridasaktivitet vid CD
Den gyllene standarden för att diagnostisera CD och följa effekten av GFD är undersökning av duodenalbiopsier i samband med CD-serologi, inklusive vävnadstransglutaminas. Mätning av DS-aktiviteter ger ytterligare information vid tidpunkten för diagnos och under uppföljning för att bedöma svaret på en GFD . Dessutom har det visats att bestämning av DS-aktiviteter kan underlätta diagnosen av CD när mildare histologiska förändringar ses, inklusive Marsh I- och II-avvikelser i tunntarmsbiopsier .
2.1. Positiva och negativa prediktiva värden för mukosal villous atrofi
Mätningen av borstgränsenzymaktiviteter erbjuder ytterligare ett objektivt verktyg för att utvärdera svårighetsgraden av de histologiska avvikelserna hos obehandlade celiakipatienter . Duodenal DS-aktiviteter är goda prediktorer för graden av mukosal villusatrofi vid CD. Positiva prediktiva värden för måttlig eller allvarlig villusatrofi är följande:(i)90 % för maltas (maltas U/g protein)(ii)86 % för sukras (<40 U/g protein)(iii)71 % för laktas (<20 U/g protein).
Förminskade maltas- och sukrasaktiviteter har således ett högt positivt prediktivt värde för graden av slemhinnans villusatrofi. Prediktiva värden för laktasaktivitet är lägre, vilket troligen beror på förekomsten av primär laktasbrist hos celiakipatienter. Ingen patient med DS-aktiviteter i det normala intervallet uppvisade allvarlig villatomtrofi .
2,2. Slemhinneläkning vid CD med glutenfri kost (GFD)
Det är väl etablerat att borstgränsenzymaktiviteterna är reducerade hos obehandlade celiakipatienter. Aktiviteterna återhämtar sig dock under remission, särskilt fyra veckor efter att man börjat med GFD . Det är viktigt att notera de olika reaktionerna mellan DS och GFD; det sker en markant ökning av alfa-glukosidasaktiviteterna, medan laktasaktiviteten förblir låg hos många patienter . Peña et al. visade att laktasets reaktion på en GFD är varierande och att det ibland sker en fullständig återhämtning inom några månader, men att den ibland förblir nedsatt i flera år . Patientens ålder har stor betydelse för hur snabbt laktasaktiviteten återställs. Patienter som är yngre än 30 år uppvisar vanligtvis fullständig återhämtning inom några månader, medan de flesta äldre patienter uppvisar liten eller ingen återhämtning under denna tidsperiod . I andra studier har det visats att det finns en fortsatt låg laktasaktivitet trots god histologisk förbättring hos vissa patienter, särskilt vuxna.
Med undantag för laktas kan mätningen av DS ge ett kvantitativt index för förbättring av tunntarmsslemhinnan; ökningen av DS korrelerar väl med återhämtningen av slemhinnan enligt tunntarmens biopsihistologi. Förutom histologisk och serologisk uppföljning erbjuder mätning av DS-aktiviteter ytterligare ett potentiellt verktyg för att utvärdera behandling av CD med GFD . Sucraseaktivitet är den bästa indikatorn på slemhinnans svar på en GFD. Det är dock intressant att notera att även efter två års behandling av CD med GFD ökar inte sukrasaktiviteten i distala duodenum till samma nivå som hos kontrollerna, även om kliniska effekter observeras tidigare . Generellt sett är enzymaktiviteterna i tunntarmsslemhinnan hos patienter med CD i remission lägre än i kontrollgrupper som matchats med avseende på ålder, kön och biopsiplats . Celeiakipatienter som får GFD har dock signifikant ökade nivåer av maltas och sukras men begränsad ökning av laktasaktiviteten jämfört med en obehandlad grupp . Det är värt att nämna att en strikt GFD är den bästa behandlingen inte bara för CD utan även för CD-associerade sekundära DS-brister .
2.3. Diagnos av CD med Marsh I/II-poäng på slemhinnebiopsier från tunntarmen (subklinisk CD)
I slemhinnebiopsier från tunntarmen med Marsh-poäng på I och/eller II finns det ingen villusatrofi . Villusatrofi utgör endast slutstadiet i sjukdomens kliniska förlopp; CD utvecklas gradvis från tunntarmsslemhinneinflammation till kryptohyperplasi och slutligen till villusatrofi .
Mildare biopsiförändringar som är begränsade till lymfocytinfiltration med eller utan kryptohyperplasi kan kräva ytterligare uppgifter för att öka säkerheten för en CD-diagnos, eftersom dessa histologiska förändringar inte är exklusiva för CD . Diagnosen CD kan förbättras genom genotypning (HLA-DQ2 eller HLA-DQ8); serologiska markörer och immunohistokemisk färgning av γδ+ve intraepiteliala lymfocyter som finns hos patienter med CD kan också användas för att bekräfta diagnosen .
Skador på mikrovilli kan vara en av de tidigaste gluteninducerade förändringarna vid CD . Därför kan biokemiska förändringar föregå histologiska avvikelser i duodenalbiopsi som observeras med ljusmikroskopi . Murray et al. rapporterade att diagnosen CD ställdes vid upprepad biopsi hos 4 av 37 (10,8 %) patienter som inte hade någon villusatrofi i sin första biopsi några år tidigare. Dessa fyra patienter hade dock minskad DS-aktivitet och mindre histologiska förändringar (Marsh I eller II) i sin första biopsi. Minskad DS-aktivitet utan villatomställning kan därför representera tidig CD.
Mones et al. observerade en markant minskning av DS-aktiviteten hos pediatriska patienter med CD vars histologiska förändringar i deras tunntarmsbiopsier gavs poäng som Marsh I eller II (med intakta villi). Ett positivt test för att förutsäga CD definierades genom följande gränsvärden för individuell DS-aktivitet: laktas, ≤15 enheter/g protein, sukras, ≤25 enheter/g protein, maltas, ≤100 enheter/g protein och palatinas, ≤5 enheter/g protein. Den diagnostiska känsligheten varierade mellan 74 % och 85 %, med den högsta känsligheten för laktas. Den diagnostiska specificiteten varierade från 57 % till 91 %, med den högsta specificiteten för sukras. Det positiva prediktiva värdet av en DS-brist för att förutsäga CD varierade från 70 % till 91 %. Negativa prediktiva värden (en normal DS-nivå) varierade från 72 % till 76 % för att förutsäga en biopsi som inte anses vara CD . DS-brist som upptäcks i duodenalbiopsier kan därför underlätta diagnosen av CD i biopsier med intakta villi . Ett liknande resultat rapporterades i en annan studie där utvärdering av DS-aktiviteter gav bevis för att stödja diagnosen CD hos vissa patienter .
3. Forskningsaspekter av disackaridasaktiviteter vid celiaki
DS-aktiviteter i slemhinnebiopsier från tunntarmen kan bestämmas med Dahlqvistmetoden. Vävnaden inkuberas med den relevanta disackariden och frisatt glukos bestäms genom kolorimetrisk analys med TRIS-glukosoxidas-reagens. Enheterna för DS-aktivitet uttrycks som mikromol disackarid som hydrolyseras per minut per gram slemhinna (våtvikt) .
3.1. Faktorer som påverkar enzymaktiviteten
DS är nedsatt vid aktiv celiaki. De kan vara reducerade vid andra tillstånd, inklusive inflammatorisk tarmsjukdom, födoämnesallergi, dyspepsi, protein-energimalabsorption, immunbrist och infektionssjukdomar (t.ex. giardiasis, virusinfektioner och bakteriell överväxt i tunntarmen) . Minskningen av DS-aktiviteterna kan vanligtvis vändas genom framgångsrik behandling av den underliggande sjukdomen. Intressant nog kan DS också öka onormalt hos diabetespatienter . En minskning av enskilda DS-brister ses vid primära DS-brister som omfattar medfödd laktosintolerans, sucrase-isomaltasbrist, maltas-glukoamylasbrist och trehalasbrist .
Hos friska individer kan DS-aktiviteterna uppvisa ett brett spektrum av absoluta värden . Det finns flera endogena och exogena faktorer som påverkar deras aktiviteter.
3.1.1. Endogena faktorer
DS-aktiviteterna varierar längs tarmens längsgående axel (duodenum-jejunum-ileum) . Laktas har maximal aktivitet vid 50-200 cm från Treitz ligament och saknas nästan helt i distala ileum. Sukrasaktiviteten är konstant längs tunntarmen. Maltas är dubbelt så rikligt förekommande i distala ileum jämfört med det i proximala jejunum .
Ethnicitet påverkar DS-värdena, vilket visades när man jämförde afrikanska och finländska barn med normal villusarkitektur; de förstnämnda hade lägre aktiviteter av duodenalt laktas, sukras och maltas. Ungefär en tredjedel av de finska barnen uppvisar en laktasaktivitet under det fastställda referensintervallet på 20 U/g protein, till skillnad från två tredjedelar av de afrikanska barnen .
Kön påverkar inte någon av DS-aktiviteterna . Ålder har en signifikant effekt endast på laktasaktiviteten; den minskar med åldern. Hos vissa svarta barn kan laktasbrist utvecklas efter 3 års ålder och är inte förknippad med slemhinnesjukdom .
Cirkadisk rytm påverkar DS-aktiviteter . Dessutom korrelerar svängningar av DS-aktiviteterna med rytmen för födointag .
Patchiga slemhinneförändringar som kan förekomma vid CD påverkar de absoluta värdena av DS-aktiviteter som hittas i biopsier. Jonsson et al. visade att det fanns en variationskoefficient på cirka 30 % i DS-aktivitet för prover tagna från två platser i duodenum.
3.1.2. Exogena faktorer
Det är känt att utfodring med sackaros ökar aktiviteten hos sackaros-isomaltas. Ökningen är ett resultat av de novo-syntesen av enzymet som når sin topp (2,6-faldig ökning) 12 timmar efter att man börjat äta en sackarosinnehållande diet . Nedbrytningen av enzymet är oberoende av kosten .
Fastan hämmar tarmepitelcellernas förnyelse. Det orsakar en minskning av tunntarmens massa, villostorlek och krypt enterocyternas mitotiska index. Kolhydratbrist inducerar ett fall i intestinal sukras som återställs genom kolhydratmatning .
Nivåerna av DS varierar också beroende på platsen för biopsin . Detta gäller inte bara den longitudinella axeln (duodenum-jejunum-ileum) i tunntarmen utan även axeln mellan kryptor och killar. Eftersom DS är inbäddade i mikrovilli av villösa enterocyter är deras aktivitet beroende av antalet villösa enterocyter som finns i biopsin, så att de mer ytliga biopsierna som har ett högre epitelinnehåll kan ha ett högre innehåll av DS.
3.2. Ex vivo- och in vitro-metoder för att studera glutentoxicitet vid celiaki
Det finns ingen djurmodell som reproducerar alla kännetecken för celiaki . In vivo-testning är den gyllene standarden för att bedöma celiakitoxicitet . Det är dock väl etablerat att in vivo administrering av gluten kan orsaka systemiska skador hos patienten. Därför används vanligen in vitro-metoder innan in vivo-studier genomförs när man bedömer om livsmedel är toxiska för gluten.
Den mest tillförlitliga in vitro-metoden är biopsiodling av tunntarmsslemhinnan, ofta kallad duodenalbiopsiorganodling (OC). Metoden beskrevs ursprungligen av Browning och Trier . Det finns betydande krav på prekliniska in vitro-studier, så principen för Browning och Triers metod har vidareutvecklats och tillämpats för att testa probiotika som kräver en apikal stimulering av tarmslemhinneexplantat . OC möjliggör olika andra tillämpningar, t.ex. biokemiska studier av syntes och bearbetning av DS , dimerisk sammansättning av DS , och studier av insulinets effekter på förhöjd DS-aktivitet hos diabetiker .
Browning och Triers ursprungliga metod har modifierats så att systemet upptäcker glutenets skadliga effekter genom att tillsätta det till odlingsmediet och utvärdera efterföljande histologiska, morfologiska och immunologiska abnormiteter. Den modifierade Browning och Triers teknik används fortfarande i stor utsträckning i studier som undersöker CD:s patogenes och vid testning av celiakitoxicitet . OC-systemet har också visat sig vara användbart för att underlätta diagnosen av CD, främst i fall utan villusatrofi eller hos seronegativa patienter .
3.2.1. Tidiga arbeten med odling av små tarmorgan och studier av enzymer i borstkanten vid celiaki
Enterocytskador är kännetecknande för celiaki . Den toxiska effekten av gluten på tunntarmsslemhinnan påvisades biokemiskt genom att mäta aktiviteten hos borstgränsenzymet alkaliskt fosfatas (AP) i OC. Aktiviteten hos AP från biopsier från obehandlade CD-patienter ökade när vävnaden inkuberades i glutenfritt medium. Denna ökning hämmades av närvaron av glutenpeptider i odlingsmediet, vilket visar glutenets toxiska effekter.
Katz och Falchuk föreslog därefter att OC-tekniken i tunntarmen skulle användas som ett prediktivt test för den definitiva diagnosen av glutenkänslighet. Tjugotvå av 26 patienter med diagnosen CD hade visat glutenkänslighet in vitro på sina första biopsier. En ökning av AP-aktiviteten i tarmvävnad från dessa 22 patienter hämmades av förekomsten av glutenpeptider i mediet. Den falskt negativa andelen för att fastställa diagnosen CD var därför 15 % (4 av 26). I deras studie fanns det också 14 patienter med onormal slemhinna som visade sig inte ha CD. Tretton av dem uppvisade inte glutenkänslighet in vitro (en falskt positiv frekvens på 7 %). Alla patienter med normala biopsier klassificerades korrekt. Dessa spännande resultat tyder på att odling av tunntarmens organ kan användas för prospektiv diagnos av CD. I en annan studie visade Falchuk et al. återigen glutenkänslighet in vitro hos patienter med aktiv CD. De antydde vidare att det fanns skillnader beroende på försökspersonernas histokompatibilitetstyp.
Andra forskare genomförde liknande OC-studier och mätte AP-aktivitet och ett annat borstgränsenzym α-glukosidas. Howdle et al. och Hauri et al. kunde inte reproducera in vitro effekter av gluten på duodenalbiopsier från obehandlade CD-patienter och inte heller genom bedömning av AP- eller α-glukosidasaktivitet.
Mitchell et al. visade att det sker en progressiv förlust av proteiner från vävnaden under OC. Samtidigt minskar nivåerna av borstgränsenzymer och ackumuleras i mediet. De föreslog därför att man skulle uttrycka enzymaktiviteter som mU/ml odlingsmedium, i stället för U/g protein, på grund av proteinförluster under organodling och återvunna enzymaktiviteter i mediet .
Flera författare undersökte proteinerna, DNA-innehållet och borstgränsenzymerna i tunntarmsbiopsi OC. De flesta har observerat en minskning av alla dessa parametrar i odlade biopsier med undantag för AP-aktiviteten som ökade i praktiskt taget alla fall . DS försvinner förmodligen lättare i mediet under odlingen än AP .
3.2.2.2. Cellmodeller och enzymaktiviteter
Inom CD-patienters tunntarmsslemhinna OC har forskarna använt olika cellinjer för in vitro-studier av CD. Etablerade cellmodeller bygger på glutenkänsliga T-cellinjer och kloner som isolerats från personer med CD, som fortfarande används i stor utsträckning vid screening för CD-toxicitet . Betydande mängder forskning har också bedrivits med hjälp av epitelcellinjer av cancerursprung som är relativt lätta att odla. Det är dock inte fastställt i vilken utsträckning malign omvandling påverkar deras eventuella beroende av omgivande mikromiljöinfluenser. Det har visats att till skillnad från normala epitelceller behöver cellinjer för tjocktarmscancer inte tillsättas tillväxtfaktorer för att expandera in vitro . Dessutom uttrycker Caco2-celler betydligt mindre mängder borstgränsenzymer jämfört med normala enterocyter.
Innan Sato et al. publicerade sin banbrytande upptäckt om tarmorganoider var enterocyter notoriskt svåra att odla in vitro. Under årtionden har många studier av normalt tarmepitel rapporterat om svårigheter att upprätthålla odling av dessa celler i mer än några dagar ( och referenser däri) trots att man använt olika isoleringsprotokoll och efterföljande odlingsförhållanden. Under många år trodde man att långtidskulturer från primär mänsklig vävnad inte kunde etableras om cellerna inte var genetiskt transformerade. Man upptäckte också att störningar i interaktionen mellan normala epitelceller och den omgivande extracellulära matrisen leder till apoptos av cellerna.
Quaroni et al. lyckades dock etablera en långtidskultur av epitelceller från råttans tunntarm. Deras ursprungliga tillvägagångssätt för isolering var det som användes i OC, men de odlade epitelcellerna hade drag av odifferentierade kryptceller från tunntarmen. Dåliga differentieringsnivåer hos odlade enterocyter in vitro rapporterades i andra studier där man använde biopsier av tarm från människa, mus, råtta och nötkreatur, vilket stämmer överens med våra observationer (opublicerade uppgifter). Rusu et al. studerade differentiering in vitro genom att bedöma specifika aktiviteter av maltas och AP i prover från nötkreatur av a) nyskrapade epitelceller, b) organoidsuspensioner som används för att såddkulturer (inte att förväxla med Satos organoider) och c) tarmcellkulturer som innefattar primärt odlade celler och celler som odlats efter den första och andra passagen. Organoidsuspensioner uppvisar en 50-procentig minskning jämfört med det färska epitelpreparatet. Maltasaktiviteten som används som en differentieringsmarkör minskade tydligt i primära kulturer och med efterföljande odlingspassager mot en stabil låg nivå. Liknande resultat erhölls vid mätningar av tarmens AP-aktivitet. Dessa resultat återspeglade en förlust av celldifferentiering in vitro .
Epitelet är bara en (i) av fyra komponenter i en integrerad funktionell enhet som också består av (ii) extracellulär matris, (iii) mesenkymavledda celler och (iv) luminalfaktorer. Isolering av enterocyter från deras mesenkymala miljö leder till förlust av differentiering. Icke-transformerade mänskliga foster-tunntarmsceller som odlas på plast har egenskaper som odifferentierade krypto-enterocyter . Den sekventiella tillsättningen av bindvävsmolekyler och luminalmolekyler till icke-maligna enterocyter från mänskliga foster in vitro inducerade ett spektrum av förändringar i den epiteliala celltypen i riktning mot fullständig differentiering . En cellinje från tunntarmen hos råttor differentierades också, vilket bedömdes genom en signifikant ökning av sukrasaktiviteten, när den odlades i närvaro av mesenkym . Normal utveckling och differentiering av tunntarmsepitelet är därför beroende av interaktionen med mesenchym och andra beståndsdelar.
Långtidskulturer av normala primära humana epitelceller isolerade från tunntarmen är nu väletablerade. Mänskliga epitelceller i ”minitarm” kan odlas från tarmkryptor och enskilda stamceller . Det är möjligt att föröka organoidkulturer in vitro som härstammar från både mus- och människotarm . Dessa organoider kan odlas på obestämd tid och uppvisar alla kännetecken för tunntarmsepitelet när det gäller arkitektur, celltyper och självförnyelseegenskaper.
Sato et al. definierade de förhållanden som främjade proliferation och differentiering av organoider. Stamceller såväl som organoider behövde bäddas in i Matrigel som är en laminin- och kollagenrik matris som efterliknar den basala lamina. Odlingen av människans tunntarm är mer komplex än musentarmens. Förutom R-spondin, Noggin och epidermal tillväxtfaktor kräver de humanoptimerade odlingsförhållandena fler tillägg (Wnt3A, gastrin, nikotinamid, Alk-hämmare och p38-hämmare). Differentiering av odlade humana små epitelorganoider till olika celltyper i tarmen kräver att vissa tillskott tas bort (Wnt3, nikotinamid och p38-hämmare). En differentieringsmarkör för mogna enterocyter synliggjordes genom AP-färgning vid borstgränsen. I en annan studie utelämnade Middendorp et al. också vissa odlingstillskott för att uppnå differentiering av tunntarmen hos mänskliga organoider. Intressant nog fungerade visualiseringen av mogna enterocyter genom färgning med sucrase-isomaltas bra för ileala organoider men inte för duodenala. Uttryck av laktas inducerades i både ileala och duodenala organoider av det så kallade differentieringsmediet.
3.2.3. Nya framsteg inom metoder för tarmorganoider
Organoidtekniken kan ha tillämpningar inom regenerativ terapi för vissa tarmsjukdomar genom ex vivo-expansion av tarmepitel och transplantation . Denna metod gör det också möjligt att in vitro föröka sjuka gastrointestinala vävnader, vilket skulle kunna belysa sjukdomspatogenesen och utveckla terapier . Tarmorganoider har redan använts för att modellera monogena sjukdomar som påverkar epitelet, inflammatoriska tarmsjukdomar (där man undersöker celldöd, slemhinnans integritet och effekterna av inflammatoriska cytokiner) och interaktioner mellan tarmvävnader och mikrober samt cancer ( och referenser där). Forskningen om CD släpar efter dessa framsteg. Det är väl etablerat att det finns många celltyper som är involverade i CD-patogenesen och därför saknar organoider många av de celltyper som finns i ett in vivo-system. Komplexiteten kan dock ökas genom samodling med immunceller. Nozaki et al. beskrev kokultur av murina organoider och intraepiteliala lymfocyter (IEL) där både αβT- och γδT-celler prolifererade framgångsrikt och var lika rörliga som IEL som finns i in vivo-miljöer. Kokulturer av organoider har också beskrivits för det enteriska nervsystemet och myofibroblaster .
På grund av framsteg inom serologisk och genetisk testning vid diagnostisk utredning av celiaki kanske duodenalbiopsi inte längre är nödvändig för många patienter. Biopsimaterialet kommer därför att bli sällsynt. Tarmorganoider kan emellertid också genereras från embryonala stamceller eller inducerade pluripotenta stamceller ( och referenser däri) som, även om de tar längre tid att etablera och är tekniskt mer krävande och kostsamma jämfört med organoider som härrör från biopsi, i hög grad kan öka antalet resulterande organoider och göra det möjligt att i stället använda det kliniska materialet för att odla fram immuncellerna.
3.2.4. Relevans av intestinala organoiders arbete och borstgränsenzymer för utvecklingen av moderna in vitro-metoder för CD-forskning
Det är väl etablerat att medfödda och adaptiva immunsvar utlöses i CD-patogenesen ; den exakta sekvensen av dessa patologiska händelser har dock hittills inte klarlagts. Organoidtekniken möjliggör dock sekventiell tillsättning av cellerna i kokulturen, vilket gör det möjligt att studera det medfödda immunsvaret genom att rekonstituera organoider av celiaki och IELs separat från effekterna av ett adaptivt immunsvar. I sin tur kan gluten-specifika T-celler, som också kan odlas in vitro, sedan inkluderas i denna in vitro-modell av CD för att underlätta de fullständiga toxiska effekterna av gluten på tarmepitelet.
Organoidtekniken gör det också möjligt att belysa enterocyternas roll i bearbetningen av gliadinpeptider vid CD. Enterocyter har kapacitet att fungera som antigenpresenterande celler, varvid stimulering av T-celler förmedlas av deras HLA-DR-molekyler . Vidare innehåller gliadin peptider som kan utlösa ett medfött immunsvar . Intressant nog bearbetas den glutenpeptid som utlöser det medfödda immunförsvaret vid celiaki annorlunda i enterocyten jämfört med de peptider som utlöser ett adaptivt immunsvar, där peptiderna når HLA-DR-positiva sena endosomer och presenteras för T-celler i lamina propria . Eftersom skador på enterocyternas borstgräns är en av de tidigaste förändringarna vid sjukdomen kan DS användas för att studera de toxiska effekterna av gluten vid sjukdomen. Det är viktigt att notera att enzymer i borstkanten är en integrerad del av mogna enterocyter i villan och att de är kvantitativt förknippade med deras differentiering . Det är dock möjligt att DS-aktiviteten inte korrelerar med enterocyternas livsduglighet, eftersom borstgränsenzymaktiviteterna har påvisats i icke livskraftiga epitelceller . Därför kan immunfärgning, eller närmare bestämt avsaknaden av immunfärgning av borstgränsenzymer på grund av förstörelse av mikrovilli snarare än deras aktivitet, användas som en markör för CD-patogenes.
Organoidteknik har en betydande potential för sjukdomsmodellering och därmed för att belysa sekvensen av sjukdomsframkallande händelser vid CD, där borstgränsenzymerna kan användas. Nya in vitro-modeller baserade på de senaste framstegen inom stamcellsforskningen kan underlätta utvecklingen av nya terapeutiska strategier för CD.
4. Slutsatser
Tunntarmsslemhinnans struktur och de fysiologiska processer som är inblandade är mycket komplexa. CD ökar denna komplexitet och påverkar många komponenter i tarmen, inklusive DS. Trots att DS-verksamheten har spelat en viktig roll för att underlätta diagnosen av CD, har det ännu inte fastställts hur DS-verksamheten ska tillämpas i in vitro-forskningen av CD. De senaste framstegen när det gäller ex vivo-tillväxt av epiteliala ”minidurkar” utgör en ny spännande plattform som har blivit tillgänglig. Den gör det möjligt att studera normalt eller sjukt epitel med hjälp av vävnadsteknik. Epitelceller växer och differentieras under definierade förhållanden som omfattar närvaron av en extracellulär matris och tillväxtfaktorer. En självförnyande population av epitelceller uttrycker borstgränsenzymer som kan användas i in vitro-studier av CD när andra immunceller återskapas i modellen.
Intressekonflikter
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. H. Julia Ellis för hjälpsamma diskussioner och granskning av manuskriptet. Tanja Šuligoj vill tacka Clinical Research Trust för stödet. Borut Božič vill tacka för det partiella ekonomiska stödet från Slovenian Science Foundation, Grant no. SZF-BBozic01/2007.