Den klonogena analysen har använts i ett stort antal studier för att kvantifiera klonogen tillväxt och dess upphävande av cytotoxiska stimulansmedel, inklusive strålning, kemoterapeutiska läkemedel och/eller molekylärt riktade agenter, in vitro. Det nuvarande standardförfarandet för att bestämma överlevnadsfraktioner bygger på antagandet att den klonogena tillväxten i behandlade cellkulturer kan normaliseras till de obehandlade kontrollerna genom att dela med en celllinjespecifik, konstant PE.
Här visar vi dock att detta inte är universellt tillämpbart. Däremot visar våra data tydligt att korrelationen mellan antalet celler som såtts i en kulturskål och antalet erhållna kolonier långt ifrån alltid är linjär. För cellinjer med kooperativt beteende gav den PE-baserade analysen av uppgifter om klonogen överlevnad resultat med stora till enorma testintrinsiska fel. Även om endast odlingsskålar med ett rimligt antal kolonier (C = 5-100) användes för analysen, skiljde sig de klonogena överlevnadsfraktionerna vid en given dos åt med långt mer än en storleksordning för cellinjer med hög grad av cellulärt samarbete. Noterbart är att praktiskt taget vilken överlevnadskurva som helst (brant eller platt, måttligt eller starkt krökt, linjär, kvadratisk eller oregelbunden) kan härledas från detta intervall av resultat som beräknats från den givna datamängden – en observation som kan vara av särskild betydelse för strålningsbiologer.
Tillsammantaget visar våra data att konventionell PE-baserad analys av klonogena överlevnadsdata presterar olämpligt så snart cellsamarbete förekommer under en eller flera förhållanden inom ett experiment, och de utvunna överlevnadsresultaten kommer att variera inom ett otillfredsställande stort intervall. Särskilt kommer resultaten att bli kraftigt snedvridna om endast en eller ett fåtal liknande celltätheter plottas ut. Detta tillvägagångssätt ger upphov till testintrinsiska fel som är en direkt följd av de valda celltätheterna och som därför inte kan analyseras med hjälp av statistiska felanalyser. När det gäller cellinjer som odlas i samarbete kan våra observationer delvis förklara rapporterade avvikelser mellan försök, forskare och laboratorier när det gäller data om behandlingssvar. En metaanalys av data från A549-kolonibildningsanalysen stöder ytterligare denna hypotes: Inom en panel av 156 olika studier rapporterade Nuryadi et al. om SF4-värden för denna specifika cellinje som varierade från 5 till 90 % med ett SF4-interkvartilområde på mer än 25 % . Även om olika andra parametrar säkert kan påverka data om behandlingssvar, drar vi slutsatsen av våra data att cellulärt samarbete är en viktig faktor som förklarar variabiliteten mellan olika studier. Eftersom även små skillnader i klonogena överlevnadsfraktioner kan uppmuntra forskare att postulera och studera nya vetenskapliga hypoteser som i slutändan kan vara baserade på falsk precision, har vi utvecklat en ny analysmetod som är mindre känslig för inverkan av celltäthet – särskilt, men inte bara, för cellinjer som växer i samarbete. Denna metod tar hänsyn till icke-linjära förhållanden mellan antalet sådda celler och antalet kolonier som erhålls genom att poängsätta odlingsskålar med ett brett spektrum av antalet sådda celler för alla behandlingsförhållanden.
Matematiskt sett utnyttjar vårt tillvägagångssätt effektregression och interpolering av matchade antal kolonier vid olika bestrålningsdoser. Tillämpat på samma dataset som användes för PE-baserade beräkningar gav det klart mer stabila, celltäthetsoberoende resultat. Uppmärksamma läsare kanske har lagt märke till att de beräkningar av överlevnadsfraktionerna som utförs enligt den metod som presenteras här enbart bygger på koefficienten a och exponenten b som utvinns genom kraftregression. Även om detta uppenbarligen kompenserar för effekterna av cellsamarbete, har det en annan felkaraktär som härrör från regressionens oprecision och som inte kan jämföras kvantitativt med den liknande felkaraktären i PE-baserade beräkningar av överlevnadsfraktioner. Följaktligen bör detta fel minimeras genom en noggrann experimentell utformning med ett tillräckligt antal oberoende replikat. Dessutom bör överlevnadsfraktionsberäkningar endast utföras med effektregressionsresultat med korrekt prestanda, vilket indikeras av regressionskoefficienten R.
Vår matematiska metod ersätter i princip PE-baserade klonogena överlevnadsberäkningar med frågan:
Hur många gånger fler celler måste sås i en behandlad odlingsskål för att ge identiskt antal kolonier som i en kontrollskål?
Exponenten b är av särskild betydelse i detta avseende. Den anger om korrelationen mellan antalet sådda celler och antalet räknade kolonier är linjär (b ≈ 1) eller inte. Höga b-värden, som de som erhållits för BT20- och SKLU1-celler, indikerar att celltillväxten in vitro bromsas (eller helt upphör) om volymen odlingsmedium per cell ökas – antingen genom användning av stora analysvolymer eller minskning av antalet sådda celler. Det bör betonas att b-värdena inte på något sätt är specifika för en viss cellinje utan snarare en följd av det valda cellodlingsmediet, flera inkubationsparametrar och det experimentella förfarandet, inklusive praktiskt taget alla aspekter som kan påverka den klonala utväxten av celler som befinner sig i en extrem stresssituation när de plottas ut som enskilda celler, t.ex. mediets sammansättning, tillskott av näringsämnen och tillväxtfaktorer, metoder som används för cellseparation, plastmaterial osv. Användning av konditionerade medier från BT20-celler som är nära konfluenta minskade till exempel kraftigt det kooperativa beteendet hos BT20-enkeltceller, medan detta förfarande inte hade någon inverkan på den klonogena tillväxten hos MDA-MB231-celler som inte växte kooperativt. Dessutom var fördubblingstiden för kooperativa BT20-celler beroende av både inkubationstid och celltäthet i brunnen, vilket ger en självklar biologisk förklaring till de oprecisa klonogena överlevnadsfraktioner som erhålls genom PE-baserade beräkningar: Ett prolifererande cellklusters tillväxthastighet kan helt enkelt vara för långsam för att nå tröskelvärdet på 50 celler per koloni inom testets inkubationstid. Den uppenbara ”icke-klonalitet” hos ett kluster av t.ex. 35 långsamt prolifererande celler vid stopptidpunkten är därför bara en oundviklig konsekvens av testinkubationstiden, som – åtminstone i viss utsträckning – är godtyckligt vald. I detta sammanhang analyserade vi dessutom inkubationstidens inverkan på de erhållna klonogena överlevnadsfraktionerna och konstaterade att det är otillräckligt att bestämma stopptidpunkten enbart genom att inspektera kontrollplattorna, vilket föreslagits av andra: Ett för tidigt avslutande av inkubationstiden kan leda till extremt låga överlevnadsfraktioner på plattor med aggressivare behandling, där det krävs ytterligare tid för att reparera skadorna innan celltillväxten fortsätter.
Viktigt nog är våra data helt i linje med banbrytande resultat från banbrytande cellkulturforskare på 1940- och 1950-talen och återspeglar helt enkelt ett fenomen som var föremål för omfattande undersökningar vid den tiden. Puck och kollegor var de första att publicera en överlevnadskurva för bestrålade enskilda celler 1956. Den största vetenskapliga utmaningen för denna grundläggande prestation var dock ett vid den tiden olöst problem med däggdjurscellodling: Cellinjer upphörde att växa in vitro så snart cellerna plöjdes ut vid låg densitet. Ett försök att lösa detta problem gjordes 1948 av Sanford et al. som lyckades odla fibroblastkolonier som härrörde från enskilda celler i små kapillärer där spridningen av cellrelaterade faktorer till mediet var starkt reducerad, vilket möjliggjorde tillräcklig autokrin tillväxtstimulering . De identifierade vikten av att förkonditionera odlingsmediet med odlade celler och drog slutsatsen att ett cellodlingsmedium som är tillräckligt för att möjliggöra oändlig tillväxt av en cellkultur med hög densitet i själva verket är ”långt ifrån optimalt för tillväxt av en enskild cell”. I linje med detta beskrev Earle et al. att plottning av respektive celltyp vid mycket låg densitet resulterade i celldöd , och detta arbete låg till grund för den första publikationen om klonogen tillväxt av däggdjursceller in vitro av Puck och Marcus 1955 . Inspirerade av behovet av konditionerat kulturmedium för att underlätta tillväxt av enstaka celler använde de ett samodlingssystem med HeLa-enkeltceller och ett skikt av kraftigt bestrålade matarceller av samma typ. I överensstämmelse med de föregående studierna drog de slutsatsen att inhiberingen av tillväxt av enskilda celler i stora analysvolymer berodde på ”förlusten av en kortlivad, diffuserbar faktor” . I senare publikationer, t.ex. den med den första överlevnadskurvan för bestrålade däggdjursceller, utelämnade Puck och kollegor ofta användningen av matarlager, eftersom de hade utvecklat avancerade odlingstekniker som möjliggör tillväxt av enstaka celler med 100 % PE utan tillskott av tillväxtfaktorer från matarceller . De konstaterade att noggranna tvätt- och trypsiniseringsprotokoll var viktiga i detta avseende och myntade termen ”cooperative action” för att beskriva att cellerna i en odlingsskål kan skilja sig åt både när det gäller genotyp och fysiologiskt tillstånd . Våra resultat bekräftar dessa observationer: Inom en panel med 50 cancercellinjer observerade vi att suboptimal tillväxt av enskilda celler i moderna, standardiserade odlingsmedier kompletterade med FCS fortfarande är ett mycket vanligt fenomen, vilket kan härledas från konstaterandet att mer än hälften av cellinjerna uppvisade ett kooperativt tillväxtbeteende. Om suboptimala PE-värden hittas för en viss cellinje är det därför troligt att den klonogena analysen samtidigt upptäcker både påverkan av den aktuella behandlingen och påverkan av cellulärt samarbete. Det låg inte inom ramen för denna studie att identifiera specifika tillväxtstödjande faktorer som kan påverka PE för de analyserade cellinjerna. Vi antar dock att suboptimala tillväxtförhållanden för enskilda celler i en viss cellinje kan bero på mycket olika parametrar, t.ex. låga koncentrationer av klassiska tillväxtfaktorer och/eller hormoner (t.ex. epidermal tillväxtfaktor eller östrogen) men också olika metaboliter med låg och hög molekylär vikt för vilka åtminstone en del av de enskilda cellerna uppvisar auxotrofi. Dessutom kommer näringstillskott till enskilda celler i en odlingsskål sannolikt att påverkas av fysikalisk-kemiska parametrar hos det omgivande mediet och plastmaterialet, inklusive graden av proteinbindning av de respektive auxotrofa faktorerna eller deras adsorption till plastytan. Teoretiskt sett skulle man kunna lösa detta problem genom att vidta åtgärder som återställer den maximala PE i förhållanden med låg densitet så att en linjär korrelation mellan S och C (åter)etableras (b = 1). Pucks rekommendationer om användning av matarceller, konditionerade medier och/eller inbäddning av enskilda celler i mjuk agar kan vara tillräckliga för att uppnå detta för utvalda cellinjer och bör öka robustheten hos PE-baserade beräkningar i enlighet med detta. Det är dock uppenbart att det kan vara mer än utmanande att förfina och standardisera testförhållandena så att överlevnaden och tillväxten av enskilda celler är optimal för varje enskild celltyp av intresse . Vi bestämde oss för att acceptera suboptimala testförhållanden för tillväxt av enskilda celler och utvecklade i stället en beräkningsmetod för analys av klonogena överlevnadsdata som tar hänsyn till detta väl beskrivna fenomen. Det är uppenbart att vårt tillvägagångssätt med hjälp av kraftregression och interpolation var bortom den tekniska kapaciteten på 1950-talet, då överlevnadsdata anpassades med ögat . På något sätt försvann dock betydelsen av cellulärt samarbete ur fokus under de följande decennierna. Även om ett fåtal rapporter om icke-linjäritet i kolonibildningsanalyser rapporterades med tiden, behandlades inte den begränsade prestandan hos PE-baserade analyser .
Interessant nog rapporterade dessa studier om en mindre än linjär ökning av antalet kolonier med ökande antal sådda celler för vissa celltyper under specifika förhållanden. I enlighet med detta fick vi för några cellinjer i vår panel också b-värden strax under 1,0. Tre olika scenarier kan förklara denna observation, varav två beror på metodologiska artefakter: För det första kan b-värden strax under 1,0 vara ett resultat av att brunnar med ett stort antal övervuxna kolonier räknas där små kolonier förbises av forskaren (se brunnar markerade med ”nd” i fig. 1a). För det andra kan celltillväxten i skålar med ett stort antal celler hämmas i ganska tidiga skeden på grund av en snabb minskning av näringskoncentrationen, vilket resulterar i kolonier som misslyckas. Ett tredje – och biologiskt mindre intuitivt – alternativ är konkurrensbeteende i celltillväxten, t.ex. på grund av utsöndring av tillväxthämmande faktorer. Det är viktigt att alla dessa fenomen beaktas av regressions- och interpolationsmetoden, eftersom den tar hänsyn till varje avvikelse från linjäritet som återspeglas av b-värdet.
Det är dessutom anmärkningsvärt att b-värdena för olika cellinjer för obehandlade jämfört med bestrålade förhållanden inte är identiska. I de flesta av dessa fall tenderar b-värdena för bestrålade celler att vara högre än motsvarande b-värden för obehandlade kontroller, vilket tyder på att det cellulära samarbetet ökar vid bestrålning. Följaktligen blir intervallet av överlevnadsfraktionsvärden som erhålls för C = 5 till 100 kolonier bredare än vid nästan identiska b-värden (se cellinjerna HCC1806 och A549). Detta innebär att det tekniskt sett inte är möjligt att få fram mer exakta överlevnadsvärden med hjälp av klonogena tester – såvida inte ett fast antal kolonier (C) väljs ut för analys. Vidare kan cellinjer med extremt höga b-värden för behandlade celler vara av särskilt intresse när det gäller studier av terapiresistens. Till exempel kan strålningsinducerade överlevnadsfaktorer som utsöndras av en viss celltyp identifieras på grund av ett motsvarande högt b-värde.
Sammanfattningsvis visar våra data på behovet av att noggrant analysera data från kolonibildningsexperiment och att ta hänsyn till den underskattade effekten av cellsamarbete på beräkningar av överlevnadsfraktioner. Detta kan i hög grad öka tillförlitligheten hos det klonogena testet – och motståndskraften hos alla hypoteser som baseras på det.