Den antimikrobiella polymeren PHMB går in i celler och kondenserar selektivt bakteriekromosomer

Aktiviteter i PHMB:s cellmembran

Om den antibakteriella aktiviteten hos PHMB (Fig. 1a) beror på membranstörning, vilket ofta har rapporterats6,7,8,9,10, skulle man förvänta sig att det permeabiliserar bakteriella cellbarriärer vid tillväxthämmande och sub-tillväxthämmande koncentrationer. För att testa denna modell fastställde vi först minimala hämmande koncentrationer (MIC) och tidsdödande egenskaper för PHMB mot Escherichia coli (stammarna K-12 och MG1655) och Salmonella enterica serovar Typhimurium (stam LT2). Som tidigare rapporterats2,4 uppvisade PHMB potenta tillväxthämmande och dödande egenskaper (kompletterande tabell 2 och kompletterande figur 1). Efter behandlingen undersökte vi också cellerna med hjälp av ljusmikroskopi. Oväntat nog lyste inte tillväxthämmande koncentrationer av PHMB cellerna, vilket övervakades med ljusfältsmikroskopi. För att bedöma skador på cellbarriären som kan vara osynliga för mikroskopi odlades E. coli K-12-kulturer till mitten av logfasen, behandlades med PHMB i närvaro av den fluorescerande membranintegritetssonden SYTOX®Green och övervakades sedan med hjälp av fluorimetri. Denna sond är användbar som indikator på membranskador, eftersom den normalt utesluts från intakta bakterier och dess fluorescenskvantutbyte ökar vid DNA-bindning. Därför förväntas intakta bakterier uppvisa låg fluorescens och fluorescensen förväntas öka efter skador på cellbarriären16. Som väntat uppvisade nyodlade E. coli-kulturer stora ökningar av fluorescensen efter behandling med den kända cellväggsbrytaren polymyxin B eller värmebehandling (fig. 1b). Oväntat nog resulterade PHMB-behandlingen i jämförelsevis lägre fluorescensnivåer. Det mest slående är att högre koncentrationer av PHMB resulterade i fluorescens på bakgrundsnivå. Dessa observationer är inte förenliga med membranstörning som den huvudsakliga antibakteriella mekanismen och väckte därför ytterligare tvivel om den etablerade modellen.

PHMB tränger in i bakterier

Om PHMB:s primära mål inte är bakteriella cellbarriärer, eller inte uteslutande cellbarriärer, så verkar den troligen internt och detta skulle kräva att man tränger in i cellen. För att testa om bakterier tar sig in, syntetiserade vi ett PHMB-FITC-konjugat (kompletterande figur 2a,b) och bedömde upptaget i grampositiva (Staphylococcus aureus), gramnegativa (Escherichia coli och Salmonella enterica serovar Typhimurium) och syrafasta (Mycobacterium smegmatis) bakterier med hjälp av mikroskopi och flödescytometri (figur 1c, kompletterande figur 3). Stark cellassocierad grön fluorescens observerades i alla testade arter (fig. 1c). För att undersöka celllokaliseringen mer ingående behandlades den stora bakterien Bacillus megaterium med PHMB-FITC, kontrafärgades med membranlokaliserande vetegroddsagglutinin (WGA-röd) och undersöktes med fluorescensmikroskopi (fig. 1d). Cellinträde observerades i både levande och fixerade celler och en analys av fluorescensintensitetsprofilen visar att PHMB-FITC lokaliserades i cytoplasman, utan ackumulering vid cellbarriären (Fig. 1e).

Observationen av att PHMB tränger in i cellerna vid låga koncentrationer av mikrogram/mL tyder på att det kan tränga in i levande celler. För att undersöka om PHMB-upptag i bakterier kräver energimetabolism, inkuberades E. coli-kulturer i mitten av logfasen vid 37 °C eller vid 4 °C i 2 timmar för att minska de cellulära ATP-nivåerna. Därefter behandlades cellerna med PHMB-FITC (0-6 μg/ml) och inkuberades ytterligare på is i 2 timmar. Cellassocierad PHMB-FITC-fluorescens kvantifierades genom fluorimetri (kompletterande figur 3b). Celler som hålls vid 4 °C uppvisade ett minskat PHMB-FITC-upptag i förhållande till celler som inkuberades vid 37 °C, vilket stämmer överens med en energiberoende cellupptagsprocess. Dessutom observerades grönt fluorescerande och rörliga bakterier vid flera tidpunkter under PHMB-behandlingen (kompletterande figur 3). Eftersom bakteriemotilitet är energiberoende17 , tyder bevisen på att PHMB-FITC kommer in i metaboliskt aktiva celler. Därför kommer PHMB in i olika bakterier och inträdet observerades i rörliga celler.

PHMB stoppar celldelningen och kondenserar bakteriekromosomer

När vi undersökte E. coli med mikroskopi noterade vi att PHMB-behandlade celler ofta uppvisade en långsträckt morfologi, vilket kan vara karakteristiskt för celldelningsinhibering (fig. 2a). För att mäta PHMB:s effekter på cellförlängningen titrerade vi PHMB i växande kulturer av E. coli stam SS996 (vide infra) och mätte celllängderna. Vid tillväxthämmande koncentrationer förlängdes mer än 80 % av cellerna (fig. 2b; kompletterande tabell 2). Vi observerade också att E. coli som behandlades med tillväxthämmande koncentrationer av PHMB eller PHMB-FITC följt av DAPI-färgning uppvisade blå fluorescerande foci nära cellcentrum (fig. 2c). Dessa strukturer liknade nukleoider18. För att underlätta visualiseringen av DNA-fokierna genererade vi filamentösa/multinukleära populationer av E. coli genom att hämma celldelningen genom RNA-stiltning av den viktiga celldelningsgenen ftsZ19. RNA-silencing valdes för det här experimentet eftersom det möjliggör specifik och kontrollerbar repression av översättning av viktiga gentranskripter20. Gener som är viktiga för tillväxten kan inte slås ut med hjälp av metoder för att bryta upp arvsmassan, eftersom detta skulle resultera i icke livskraftiga stammar. I avsaknad av PHMB uppvisade filamentösa celler en enhetlig DAPI-färgning, medan PHMB-behandlade celler uppvisade blå ”pärlsträngar” (fig. 2d). På samma sätt observerade vi i den stora grampositiva bakterien B. megaterium DAPI-färgade foci efter PHMB-behandling (fig. 2e). Dessa resultat, i både gramnegativa och grampositiva arter, visar att PHMB-exponering leder till kondenserade kromosomer i bakterier.

PHMB-medierade antibakteriella effekter är oberoende av stressresponsvägar

Cellförlängning och kromosomkondensering är karakteristiska morfologier som ofta förknippas med det bakteriella SOS-svaret21,22. Därför ansåg vi att dessa effekter skulle kunna involvera detta svar. När det gäller PHMB-medierade effekter verkade dock ett SOS-svar osannolikt. För det första är SOS-svaret vanligtvis förknippat med DNA-skador och det finns inga belägg för PHMB-medierade genotoxiska eller epigenetiska effekter23. För det andra inträffade den kondensering som observerades efter ftsZ-silensering och PHMB-behandling i en recA-stam (TOP10), som är en SOS-responsmutant. Icke desto mindre är antimikrobiella mekanismer notoriskt svåra att tyda och kan involvera flera mekanismer. Därför bestämde vi oss för att bedöma den möjliga inblandningen av ett SOS-svar och andra stressresponsvägar med hjälp av en SOS-reporterstam och en panel av E. coli stressresponsvägsmutanter.

För att testa om PHMB-medierade effekter på cellförlängning och kromosomkondensering förändras av mutationer till SOS-responsvägen utvärderade vi morfologiska reaktioner i tre muterade E. coli-stammar. Stam SS996 kan initiera ett SOS-svar, men på grund av en sulB-mutation leder svaret inte till celldelningshämning. Detta beror på att SS996 har en muterad allel av ftsZ (sulB103), vars produkt är okänslig för verkan av den SOS-inducerade celldelningshämmaren SulA24. Stammen JW2669 producerar inte funktionell RecA och är därför SOS-bristfällig. Stam AB2474 har en mutation i LexA-repressorn som gör att den inte kan spaltas av RecA och därför inte kan inducera ett SOS-svar (ytterligare uppgifter om stammarna finns i figur 3 och i tabell 3 i den kompletterande informationen). Kulturer i mitten av logfasen behandlades med PHMB, färgades med DAPI och observerades i ett fluorescensmikroskop. Som observerats med E. coli K-12 uppvisade mutantstammarna långsträckta morfologier och kondenserade kromosomer efter PHMB-behandling (fig. 3a). Därför sker PHMB-medierade effekter på celldelning och kromosomstruktur oberoende av ett programmerat SOS-svar.

För att mer direkt mäta om PHMB inducerar ett SOS-svar använde vi E. coli-stammen SS996, som är en reporterstam som innehåller ett sulAp-gfp kromosomalt SOS-svar/reportersystem24,25. Om ett SOS-svar orsakas av PHMB bör PHMB-exponering inducera GFP-uttryck i denna stam. Kulturer av SS996 behandlades med PHMB i 18 timmar och därefter mättes den gröna fluorescensen. Mitomycin C, som skadar DNA, ingick som positiv kontroll och triclosan, som hämmar fettsyrabiosyntesen, ingick som negativ kontroll. Som förväntat inducerade mitomycin C en stor ökning av GFP-uttrycket och triclosan inducerade inte GFP-uttrycket. Till skillnad från mitomycin C inducerade PHMB inte GFP-uttryck, vilket tyder på att PHMB inte inducerar ett SOS-svar (fig. 3b).

Vi testade därefter om stammar med defekta eller avreglerade SOS-svar skiljer sig åt i känslighet för PHMB. För att testa recA-medierade effekter på mottagligheten använde vi en stam av E. coli som saknar recA (JW2669) och en stam som överuttrycker recA vid tillsats av induceraren IPTG (ASKA JW2669) och bestämde MIC-värden. Varken deletion eller inducerad överexpression av recA förändrade känsligheten för PHMB (kompletterande information, tabell 3, rader skuggade i mörkgrått). Däremot var recA-stammen 2 gånger mer mottaglig för det SOS-responsinducerande läkemedlet nalidixinsyra och överexpression av recA minskade känsligheten för nalidixinsyra 8 gånger. För att testa lexA-medierade effekter på PHMB-känslighet använde vi lexA1(Ind-)-stammen AB2474, som inte kan inducera ett SOS-svar. I förhållande till föräldrastammen var AB2474 1-faldigt mer mottaglig för PHMB och 1-faldigt mindre mottaglig för nalidixinsyra (kompletterande tabell 3, rader skuggade i ljusgrått). Därför uppvisade ingen av de testade mutanterna med SOS-svar förändringar i känslighet för PHMB som tyder på inblandning av ett SOS-svar.

Slutligt undersökte vi om andra (icke-SOS) stressresponsvägar påverkar känsligheten för PHMB. Vi testade en serie kända E. coli stressresponsmutanter parallellt med deras förälder för känslighet för PHMB. Ingen av mutanterna uppvisade förändringar i MIC-värden som tyder på en funktionell inblandning av någon av stressresponsvägarna (kompletterande tabell 3). Därför uppträder de antibakteriella effekterna av PHMB oberoende av panelen av testade stressresponsmekanismer.

PHMB kondenserar bakteriella kromosomer in vitro

Om PHMB kondenserar bakteriella kromosomer inne i cellerna kan detta ske via direkta eller indirekta effekter på DNA. Vi misstänkte direkta effekter eftersom PHMB har visat sig binda till DNA-fragment in vitro15. Vi bestämde oss för att undersöka PHMB:s DNA-bindningsegenskaper med hjälp av isolerat kromosomalt DNA från E. coli. PHMB-DNA-interaktioner undersöktes först med hjälp av en elektroforetisk mobilitetsförskjutningsanalys (EMSA) och en färgämnesexkluderingsanalys. PHMB blandades med kromosomalt DNA isolerat från E. coli K-12 och blandningarna fraktionerades i agaros/TBE-geler, följt av DNA-färgning med etidiumbromid. PHMB:DNA-blandningar med vikt:vikt-förhållanden på ≥0.5 uppvisade en klart fördröjd elektroforetisk rörlighet, vilket indikeras av att DNA kvarstod i brunnen (fig. 4a). Liknande resultat erhölls för PHMB-FITC. Fördröjd rörlighet och kvarhållande i brunnarna överensstämmer med stabila interaktioner mellan PHMB och DNA. EMSA-analyserna visade också på minskad fluorescens av etidiumbromid i närvaro av PHMB eller PHMB-FITC, vilket tyder på att etidiumbromid hindras från att binda till DNA på grund av bildandet av PHMB:DNA-komplex. Denna observation undersöktes ytterligare med hjälp av det DNA-bindande färgämnet SYTOX®Green i en färgämnesexkluderingsanalys. I avsaknad av PHMB band SYTOX®Green isolerat E. coli-DNA, vilket indikeras av en stor ökning av fluorescensen i förhållande till tillsats av enbart färgämne. Om PHMB tillsattes före tillsatsen minskade dock fluorescensen med >80 % (fig. 4b). PHMB bildar därför komplex med bakteriellt DNA på ett sätt som fördröjer den elektroforetiska rörligheten och maskerar DNA:s tillgång till DNA-ligander. Resultaten av vart och ett av dessa experiment tyder på att PHMB binder direkt till DNA.

För att lära oss mer om hur PHMB:s bindning till DNA påverkar strukturen hos chomosomalt DNA använde vi biofysikaliska metoder och mikroskopi. Kombinationer av PHMB och isolerat E. coli kromosomalt DNA undersöktes med cirkulär dikroism (CD) spektroskopi. PHMB ensamt uppvisade inget karakteristiskt CD-spektrum, medan isolerat kromosomalt DNA uppvisade ett typiskt DNA-spektrum med en positiv maximal ellipticitet runt 260 nm, en negativ cross over vid 252 nm och en negativ dal vid cirka 245 nm. Detta gjorde det möjligt för oss att bedöma förändringar i DNA:s CD-spektrum efter tillsats av PHMB. Blandningar av PHMB och DNA uppvisade minskad ellipticitet vid 260 nm, vilket tyder på strukturella förändringar av DNA vid PHMB-bindning (fig. 4c,d). Dynamisk ljusspridning (DLS) visade också att PHMB-bindning till DNA resulterar i bildandet av nanopartiklar på cirka 50-60 nm, med ett lågt polydispersitetsindex (kompletterande figur 4a). Slutligen visade transmissionselektronmikroskopi (TEM) och fluorescensmikroskopi också att PHMB-bindning till DNA resulterar i bildandet av nanopartiklar (kompletterande figur 4b,c). Därför bekräftar dessa resultat tidigare rapporter om att PHMB binder DNA26 och avslöjar att PHMB binder isolerat bakteriellt kromosom-DNA och kan kondensera kromosomer till en population av nanopartiklar med låg polydispersitet.

De antibakteriella effekterna av PHMB undertrycks av en dsDNA-ligand

Våra resultat för PHMB:s effekter på bakterier kan inte förenas med membranbrytningsmodellen för PHMB:s primära antibakteriella verkningsmekanism. I stället föreslår vi en ny modell, där PHMB går in i bakterier och sedan kondenserar kromosomer, vilket illustreras i fig. 5a. Om den nya modellen är korrekt skulle den också förutsäga funktionella interaktioner mellan PHMB och andra DNA-ligander, och denna idé gav oss ett sätt att testa modellen. I korthet kan man säga att om modellen var korrekt skulle DNA-ligander med låg molekylvikt förväntas undertrycka PHMB:s antibakteriella effekt genom att konkurrera om DNA-bindningsställen i kromosomerna. För att testa denna möjlighet användes parvisa kombinationer av PHMB och Hoechst 33258 i tillväxtkänslighetsanalyser. Hoechst 33258 är en DNA-ligand som företrädesvis binder till den lilla spåret i AT-rika sekvenser27 och den är cellpermeabel, vilket gör den till ett lämpligt val för detta konkurrensexperiment.

Läkemedelsinteraktioner beräknades som värden för index för fraktionell hämmande koncentration (FICI) med hjälp av en panel av divergerande bakteriearter. FICI-värdena för PHMB:Hoechst var betydligt högre än för PHMB i kombination med något av två antibakteriella medel med icke-DNA-ligander (fig. 5b). FICI-värdena för kombinationer av PHMB:Hoechst visar också en positiv korrelation med kromosomernas AT-innehåll (fig. 5c). Med andra ord är PHMB:s antimikrobiella effekter beroende av tillgången till DNA i cellerna. I B. megaterium var effekterna av kombinationer av PHMB:Hoechst slående, där tillväxthämning av PHMB undertrycktes med subinhibitoriska koncentrationer av Hoeschst 33258 (fig. 5d). Därför räddade den småmolekylära DNA-liganden Hoechst 33258 bakterier från hämmande koncentrationer av PHMB.

Dessa parvisa läkemedelsinteraktioner avslöjar att de antibakteriella effekterna av PHMB huvudsakligen sker via inriktning på DNA i bakterier. Resultaten tyder också på konkurrens mellan PHMB och en DNA-ligand om DNA-bindningsställen inuti cellerna, vilket stämmer överens med den förändringsprofil för cellpermeabilitet som observerats för PHMB (fig. 1b). Därför är resultaten från separata experiment med två kända DNA-ligander förenliga med vår nya modell för PHMB-aktivitet.

PHMB tränger in i däggdjursceller men utesluts från kärnor

Den förhärskande modellen för PHMB-aktivitet innebär att PHMB dödar bakterier genom att bakteriemembranen skadas, och att polymeren inte interagerar med däggdjurscellmembraner (se ovan). Med tanke på de oväntade egenskaperna hos PHMB när det gäller att tränga in i bakterieceller och våra nyligen gjorda observationer att PHMB tränger in i odlade makrofager28 och keratinocyter29 beslutade vi emellertid att direkt bedöma dess förmåga att tränga in i en panel av däggdjursceller. PHMB-FITC tillsattes till flera däggdjurscelllinjer och primära fibroblaster och upptaget bedömdes med fluorescensmikroskopi och flödescytometri. Vi observerade ett tydligt upptag i alla testade celltyper (fig. 6a,b). Dessa förhållanden ledde inte heller till att däggdjurscellernas membranintegritet stördes (kompletterande figur 5a). Närmare granskning av mikroskopibilderna avslöjar att PHMB-FITC fanns i vesiklar och uteslöts från kärnor (Fig. 6a). Om det är sant att endosomerna fångar PHMB, borde frisättning i cytoplasman avbryta PHMB-FITC och leda till en ökning av fluorescensen. Detta beror på att FITC-fluorescensen släcks ut vid lågt pH och det sena endosomala pH-värdet är <630, medan det cytoplasmatiska pH-värdet är 7,4. Vi observerade att tillsatsen av klorokin, ett osmolytiskt/buffrande medel31 , ökade fluorescensen hos PHMB-FITC-behandlade celler (fig. 6c), vilket stämmer överens med att polymeren är instängd i endosomerna. Därför kommer PHMB effektivt in i däggdjursceller, men fångas in i endosomer, vilket verkar begränsa inträdet i kärnor.

.