Bookshelf

Korrigerande faktorer och igenkänningssignaler

Ett modellsystem för enzymersättningsterapi uppstod genom studier av odlade hudfibroblaster som härstammade från patienter med mukopolysackaridlagringssjukdomar (MPS). Sådana fibroblaster uppvisade överdriven ackumulering av glykosaminoglykaner, vilket tolkades bero på otillräcklig nedbrytning av dessa makromolekyler . Det upptäcktes genom en tillfällig händelse att en blandning av fibroblaster från patienter med MPS I (Hurlers syndrom) och MPS II (Hunters syndrom) hade ett normalt mönster för metabolism av glykosaminoglykaner (figur 1) . Man visste att de två sjukdomarna var genetiskt skilda, MPS I ärvs autosomalt recessivt och MPS II är en X-bunden sjukdom, vilket ledde Fratantoni et al. till hypotesen att fibroblaster av olika genotyper försåg varandra med den saknade genprodukten. Ytterligare studier visade att det inte var nödvändigt att ha de genetiskt skilda cellerna i kontakt med varandra för en sådan korskorrigering, eftersom ett medium som konditioneras av den ena kunde vara korrigerande för den andra . Strategin med korskorrigering skulle kunna utvidgas till besläktade sjukdomar – celler som korrigerade varandra skulle ha en annan genotyp, medan celler som inte korrigerade varandra skulle ha samma genotyp (se dock det viktiga undantaget nedan).

Då Hurlers syndrom hade postulerats vara en lysosomal lagringssjukdom baserat på observationer av de dramatiskt svullna leverns lysosomer hos drabbade patienter , antog Fratantoni et al. att de ”korrigerande faktorerna” i det konditionerade mediet kunde vara lysosomala enzymer som utsöndrades av den ena cellinjen och endocyterades av den andra. De korrigerande faktorerna motsvarade dock inte något lysosomalt enzym som var känt vid den tidpunkten (denna situation förändrades ett par år senare, när en β-glukuronidasbrist MPS upptäcktes ). Rening av Hurler- och Hunter-korrigeringsfaktorerna genomfördes, inte från konditionerat medium utan från urin, en kroppsvätska som är relativt rik på lysosomala enzymer. Funktion tilldelades de renade faktorerna med hjälp av olika biokemiska metoder, vilket resulterade i att Hurler- och Hunter-korrigeringsfaktorerna benämndes α-l-iduronidas respektive iduronatsulfatas .

Celler som krävde Hurler-korrigeringsfaktorn för att normalisera sin glykosaminoglykanstoffomsättning (från patienter med Hurler-syndromet och med Scheie-syndromet ) hade också brist på α-l-iduronidasaktivitet ). Korrigering av Hurler-fibroblaster åtföljdes av upptag av α-l-iduronidas. Som goda förebilder för enzymersättningsterapi var upptaget anmärkningsvärt effektivt och endast en mycket liten mängd α-l-iduronidas behövde internaliseras för att ge fullständig korrigering.

Detta kunde ha varit slutet på historien, förutom en liten diskrepans i elutionsmönstret för den enzymatiska aktiviteten och den korrigerande aktiviteten från en hydroxyapatitkolonn , vilket tyder på att de två aktiviteterna hos Hurler-korrigeringsfaktorn inte var exakt identiska. Som uppföljning av denna diskrepans separerade Shapiro et al. α-l-iduronidas i korrigerande och icke-korrigerande fraktioner på en kolonn av heparin-sefaros, vilket tyder på att den korrigerande faktorn hade någon egenskap som inte behövdes för den katalytiska aktiviteten, men som behövdes för upptaget. På samma sätt hittades flera former av β-glukuronidas, som skilde sig åt i upptag och korrigerande aktivitet .

Existensen av en specifik signal för upptag av ett lysosomalt enzym hade antytts av resultaten av en studie av en nyupptäckt sjukdom som liknade MPS – benämnd inklusionscellsjukdom (I-cell disease) på grund av de framträdande fas-täta inneslutningarna i odlade fibroblaster . Även om dessa fibroblaster hade flera brister i lysosomala enzymer innehöll det medium som omgav dem ett stort överskott av lysosomala enzymer . De enzymer som utsöndrades av fibroblaster med I-cellsjukdom endocytoseras dock inte av andra celler och var inte korrigerande; förmodligen saknade de signalen för upptag i lysosomer . Eftersom ett antal lysosomala enzymer påverkades av denna enskilda genfel (I-cell disease ärvs autosomalt recessivt), antogs signalen vara en posttranslationell modifiering av enzymproteinerna. Det antogs vidare att den var av kolhydratkaraktär, eftersom den kunde förstöras genom mild periodatbehandling . Konceptet med ett igenkänningssystem baserat på kolhydrater påverkades starkt av Ashwells och kollegors upptäckter om kolhydraternas roll i leverns upptag av cirkulerande glykoproteiner .

Närvaron av en specifik igenkänningsbar signal innebar en mättad, receptormedierad process och antydde att upptag av lysosomala enzymer skulle följa Michaelis-Mentens kinetik. Det förväntades att analoger av igenkänningssignalerna skulle uppträda som kompetitiva hämmare av upptaget. Denna förväntan undersöktes via upptag av α-l-iduronidas och β-glukuronidas av motsvarande bristfälliga fibroblaster. Kaplan et al. upptäckte att den bästa hämmaren för upptag av β-glukuronidas var mannos-6-fosfat (M6P), och deras förslag att M6P var (eller var en del av) den länge eftersökta igenkänningssignalen, var häpnadsväckande, eftersom ingen fosforylerad kolhydrat tidigare hade rapporterats finnas på däggdjursglykoproteiner . Det bekräftades omedelbart för upptag av α-l-iduronidas och andra lysosomala enzymer med hjälp av en rad olika biokemiska metoder; det slutgiltiga beviset kom från strukturell analys av de fosforylerade kolhydratgrupperna . Den signal som upptäcktes genom endocytos visade sig också vara signalen för att rikta upp spirande hydrolaser till lysosomerna .

Den defekt som uppstår vid I-cellsjukdom, som hindrar cellerna från att syntetisera M6P-igenkänningssignalen, visade sig vara en brist på det första av två enzymer som är inblandade i syntesen av M6P-signalen . Två receptorer för M6P upptäcktes; M6P-receptorernas kemi och biologi och deras roll i celltrafiken blev ett brett och mycket aktivt område inom cellbiologin . Dessa ämnen är föremål för många översikter, inklusive kapitel 3 och 5 i denna volym. M6P-systemets betydelse för enzymersättningsterapi kommer att diskuteras nedan.

Samtidigt med dessa studier i odlade fibroblaster ledde ett in vivo-system till att man fann en annan signal för upptag av lysosomala enzymer. Flera lysosomala enzymer, som injicerades intravenöst i råttor, visade sig snabbt elimineras från cirkulationen; de kvarstod dock mycket längre om de förbehandlades med periodat eller om de saminjicerades med ett agalaktoglykoprotein . Återigen antogs kolhydrater ge signaler för specifikt erkännande. I det här fallet var mannos det viktigaste sockret för igenkänning, och upptaget skedde i leverns retikuloendotelceller. Mannosreceptorn, som känner igen N-acetylglukosamin och l-fukos samt mannos, visade sig finnas på ytan av makrofager . Det är av visst historiskt intresse att experimenten med upptag av invertas, som hade en framträdande roll i det ursprungliga förslaget om enzymersättningsterapi (se ovan), lyckades eftersom invertas är ett glykoprotein med mannankedjor som känns igen av mannosereceptorn.