Biokemiska och patogena egenskaper hos Shewanella alga och Shewanella putrefaciens

RESULTAT

Biotypering av Shewanella-isolat enligt två separata system gav liknande resultat (tabell 1). De flesta kliniska isolaten (74 %) tillhörde Gilardi biovar 2 (CDC biotyp 2) och var sackaros- och maltosnegativa när de växte på SS-agar och på medier som innehöll höga NaCl-koncentrationer. Den enda större skillnad som noterades mellan Gilardis klassificeringsschema (6) och Weyant et al. (22) var att biovar 3-isolat (sackaros-, maltos-, SS- och NaCl-negativa) inte var grupperade i CDC:s biotypsystem. I motsats till de mänskliga isolaten dominerade biovar 1 (CDC-biotyp 1) (67 %) bland icke-mänskliga stammar. Dessa stammar producerade vanligtvis syra från maltos och/eller sackaros och växte inte på högsaltinnehållande eller SS-agar. På grundval av de senaste taxonomiska förslagen från Nozue m.fl. (15) skulle biovar 2-stammar (CDC biotyp 2) identifieras som S. alga medan alla biovar 1-stammar (CDC biotyp 1) och 6 av 7 biovar 3-stammar skulle betecknas som S. putrefaciens; den återstående biovar 3-stammen identifierades senare som S. alga. Kliniskt konstaterades att S. alga dominerade (77 %), medan majoriteten av de icke-mänskliga isolaten (89 %) bekräftades vara S. putrefaciens (tabell 1).

Alla tio Shewanella-isolat identifierades, när de testades på API 20E-, API NFT-, RapID NF Plus- och Vitek-systemen, somS. putrefaciens, med ett undantag. Fyra av fem isolat av S. putrefaciens gav oacceptabla profilnummer på API 20E-systemet (nr 0602026 och 0602006); den femte stammen gav ett sällsynt biotypnummer för S. putrefaciens. Alla S. alga-stammar gav utmärkt identifiering som S. putrefaciens på API 20E-systemet. API NFT-systemet identifierade alla 10 Shewanella-isolat som S. putrefaciens med god till utmärkt identifiering, med ett undantag, som också var en S. putrefaciens-stam (lågt diskrimineringsvärde, 48 timmar). RapID NF Plus identifierade alla 10 Shewanella-isolat som S. putrefaciens med 99,9 % noggrannhet. På samma sätt identifierades alla stammar av Vitek (97-99 % noggrannhet) som S. putrefaciens, även om tre S. putrefaciens-stammar krävde 5-9 timmars inkubation före slutlig identifiering, i motsats till 4 timmars resultat för de andra 7 stammarna. Kolhydratreaktioner (arabinos och maltos) på API 20E-, API NFT- och Vitek-systemen gör det dock möjligt för de flesta stammar att korrekt hänföras till de relevanta taxa (S. putrefaciens och S. alga) om de avläses manuellt efter den slutliga identifieringen som S. putrefaciens.

En jämförelse av de biokemiska och enzymatiska egenskaperna hosShewanella-arter avslöjade ett antal skillnader (tabell 2). Hemolys på fårblodagar, som rapporterats av Nozue et al. (15), upptäcktes hos allaS. alga-stammar men endast hos ett par S. putrefaciens-isolat. De flesta S. alga-stammar uppvisade denna fenotyp först efter långvarig inkubation (48 till 72 timmar), och området med hemolys var ofta oregelbundet och svårt att upptäcka. Andra aktiviteter som tidigare konstaterats bidra till att skilja S. alga och S. putrefaciens åt, t.ex. tillväxt vid 42 °C, tillväxt på medier som innehåller höga saltkoncentrationer (6,5 %) och syraproduktion från l-arabinos, sackaros och maltos, bekräftades. Vi fann ett betydligt större antal S. putrefaciens-stammar som växte på SS-agar än vad som tidigare rapporterats; de flesta av dessa härstammade från icke-mänskliga källor. Med undantag för ribose var produktionen av syra från kolhydratoxidation unikt förknippad med S. putrefaciens. Sockermönstren varierade dock avsevärt bland dessa isolat, där vissa var positiva för arabinos, maltos och sackaros medan andra endast var positiva för maltos eller var asackarolytiska (biovar 3-stammar). Flera nya enzymatiska aktiviteter upptäcktes bland utvalda Shewanella-isolat som såvitt vi vet inte tidigare har rapporterats. Dessa inkluderade tyrosinas-, alkylsulfatas-, kitinas- och elastasaktiviteter (tabell 2); de flesta av dessa enzymer påträffades i icke-mänskliga isolat avS. putrefaciens. De flesta stammar av S. alga och S. putrefaciens producerade en siderofor, vilket fastställdes genom Chrome Azurol S-analyser. Denna aktivitet var svag och fem isolat (tre S. alga- och två S. putrefaciens-isolat) lyckades inte växa på detta medium.

Selekterade Shewanella-isolat som växte bra vid 35 °C karakteriserades ytterligare för enzymatisk aktivitet med hjälp av API-ZYM (tabell 3) och för cellulär fettsyraprofil med MIDI-systemet. Av de nio substrat som angreps av en eller båda Shewanella-arter med API-ZYM var högre totala aktiviteter för sju av dessa enzymer associerade med S. alga. Den enda aktivitet som visade sig vara starkare i S. putrefaciens var valinarylamidas, även om denna aktivitet var extremt svag även i dessa stammar. Båda arterna producerade en enhetligt stark alkalisk fosfatasaktivitet. En ytterligare observation var att alla S. alga-stammar konsekvent producerade åtta av dessa nio enzymer, det enda undantaget var valinarylamidas. S. putrefaciens var däremot mer heterogen, och fyra av de nio påvisade enzymerna var inte allmänt förekommande i alla isolat. Analys av 14Shewanella-stammar visade att de dominerande fettsyrorna var i-15:0, 17:1ω8c och 16:0. Vissa stammar producerade stora mängder 16:1ω7c (9 till 18 %), medan andra producerade försumbara mängder. Även om de flesta fettsyretopparna var ganska konsekventa bland de testade stammarna av S. alga och S. putrefaciens noterades flera skillnader (Tabell4). Högre medelvärden av pentadekansyra och cis-9-heptadecensyra (17:1ω8c) noterades för S. alga, medan det omvända gällde för S. putrefaciens när det gäller hexadekansyra och dodekansyra. För hexadekansyra observerades ingen överlappning i det totala fettsyraintervallet mellanS. alga och S. putrefaciens; för pentadekansyra och 17:1ω8c producerade endast ett S. putrefaciens- eller S. alga-isolat ett värde som föll inom den andras intervall. Även om ingen enskild topp var diagnostisk, separerade användningen av alla fyra topparna tillsammans tydligt de 14Shewanella-stammarna i två grupper längs artgränserna.

Det visade sig att de 23 stammarna av S. putrefaciens kunde delas upp i tre separata grupper baserat på flera fenotypiska egenskaper (tabell 5). Grupp 1, som bestod av åtta stammar, inklusive ATCC 8073, producerade syra från maltos, sackaros och arabinos och använde urokansyra. Stammarna i grupp 1 var jämnt fördelade mellan kliniska och icke-mänskliga isolat. Grupp 2-stammar (n = 6), däribland ATCC 8071, skiljde sig främst från grupp 1-stammar genom sin oförmåga att oxidera sackaros och maltos. Återigen kom hälften av dessa stammar från kliniskt material. Stammar i grupp 3 (n = 9), som alla hade sitt ursprung i miljön (Lake Michigan-området), skilde sig dramatiskt från grupperna 1 och 2. De växte dåligt eller inte alls vid 35 °C, producerade kitinas och var opigmenterade på triptofanagar. Alla nio stammar i grupp 3 producerade ursprungligen α-glukosidas, men vid nya tester var endast tre stammar konsekvent positiva. Maltos oxiderades, men inte sackaros eller arabinos. Till skillnad från grupperna 1 och 2 utnyttjades inte urokansyra som energikälla.