Abstract
Poly(lactic-co-glycolic acid) eller PLGA är en biologiskt nedbrytbar polymer som används i ett stort antal medicinska tillämpningar. Specifika PLGA-material utvecklas också för tandvården i form av ställningar, filmer, membran, mikropartiklar eller nanopartiklar. PLGA-membran har studerats med lovande resultat, antingen ensamma eller i kombination med andra material vid benläkning. PLGA-ställningar har använts för att regenerera skadade vävnader tillsammans med stamcellsbaserad terapi. Det finns starka bevis för att utvecklingen av PLGA-mikropartiklar och nanopartiklar kan vara till nytta för ett stort antal tandvårdsområden, t.ex. endodontiterapi, karies, tandkirurgi, tandimplantat och parodontologi. Syftet med denna artikel var att granska de senaste framstegen inom PLGA-material och deras potentiella användningsområden inom tandvården.
1. Introduktion
Poly(lactic-co-glycolic acid) eller PLGA är en av de mest framgångsrikt använda syntetiska biologiskt nedbrytbara polymererna på det medicinska området och har godkänts av USA:s Food and Drugs Administration och Europeiska läkemedelsmyndigheten . Biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet, flexibilitet och minimala bieffekter är de viktigaste fördelarna när denna polymer används för biomedicinska tillämpningar. De viktigaste syntes- och nedbrytningsmekanismerna beskrivs i figur 1. I detta arbete beskrivs i detalj de nuvarande användningsområdena för PLGA inom tandvården och förhållandet mellan olika tandvårdsområden, t.ex. endodonti, parodontologi, karies, tandkirurgi och tandimplantat, och olika PLGA-material: membran, scaffolds, filmer och nano- eller mikropartiklar.
2. PLGA i tandvården
PLGA-material visar sig vara effektiva i en mängd olika dentala tillämpningar, vilket visas i figur 2. De används på en mängd olika sätt, från utveckling av skruvar för benfixering , behandling av parodontala patogener och framställning av buccal mucosa eller i direkta pulpacapningsprocedurer . PLGA kan användas vid parodontalbehandling för att förbättra den lokala administreringen av antibiotika och minska de systemiska biverkningarna av allmän antibiotikatillförsel i form av PLGA-implantat, PLGA-skivor och tandfilmer . Gelkompositvävnader av PLGA kan också användas för benregenerering, eftersom höggradigt nedbrytbara PLGA- och SiO(2)-CaO-gelvävnader som utsattes för simulerad kroppsvätska i en vecka ledde till att ett lager apatitkristaller avsattes på deras yta . Granulär komposit av gatifloxacinladdad PLGA och b-trikalciumfosfat är ett lokalt leveransmedel vid behandling av osteomyelit, eftersom kompositen lyckades leverera gatifloxacin långsamt och visade tillräcklig bakterieaktivitet in vitro mot Streptococcus milleri och Bacteroides fragilis, mikroorganismer som är ansvariga för osteomyelit. Dessutom lyckades GFLX-belastad PLGA och βTCP efter endast fyra veckors implantation minska inflammationen avsevärt och stödja osteokonduktionen och vaskulariseringen av de behandlade platserna i kaninens underkäke . Dessutom är steriliserad PLGA-ställning ett lovande material för att producera vävnadsteknisk buccalslemhinna . Dessutom kan PLGA-kompositer med biokeramiska material användas för att direkt täcka pulpan antingen genom att införliva tillväxtfaktorer i PLGA-mikropartiklar eller genom att direkt täcka pulpan med PLGA-kompositer på mekaniskt utsatta tänder . Ingen hårdvävnad observerades dock vid direkt pulpaförslutning med PLGA och pulpanekros var uppenbar på grund av PLGA:s låga vidhäftning till pulpan trots den biokompatibilitet som visades i cellprov . PLGA-kompositer med biokeramiska material förblir alltså ett bättre alternativ än enbart PLGA vid pulpacapning, med bättre vävnadsrespons jämfört med kalciumhydroxid . De lovande resultaten av PLGA-materialen tyder på att det behövs ytterligare studier, främst när det gäller tillförsel av ämnen till tandvävnad eller när det gäller PLGA-kompositernas förmåga att täcka pulpan.
3. PLGA-membran
En mängd olika polymera bioresorberbara membran används vid benregenereringstekniker eftersom de möjliggör förfaranden i ett enda steg, vilket minskar patientens obehag och kostnader samt potentiella kirurgiska komplikationer . En större benregenerering uppnås också när ett membran används vid parodontalbehandling . Med tanke på detta har PLGA-membran studerats med lovande resultat, antingen ensamma eller, på senare tid, i kombination med andra material. Tabell 1 visar de olika studier på djur och människor som gjorts om PLGA-membran inom tandvården.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PLGA-membran har studerats för periodontal regeneration. Skalpning och rotplanering följt av placering av PLGA-membran resulterade i betydande klinisk fastsättning och benförstärkning i defekter distalt från mandibulära andra kindtänder , medan ett bioaktivt och resorberbart PLGA-membran nyligen har använts i kalvarialdefekter för att förbättra benläkningen hos kaniner . Att lägga till olika aktiva substanser till PLGA-membranen ledde till förbättrade resultat. PLGA-membran med en beläggning av en atelokollagengel med rhBMP-2 användes för att rekonstruera transsektioner och defekter i underkäken, och de histologiska analyserna tyder på att PLGA-membranet gradvis absorberades och ersattes av fibrös bindväv eller benvävnad . Dessutom har PLGA-graffinerade tvåskiktsfilmer av hyaluronsyra framgångsrikt testats för styrd benregenerering hos råttor, vilket ledde till att 63,1 % av bendefektområdet täcktes, utan några negativa effekter . Hyaluronsyra-PLGA syntetiserades i form av 150 nm stora nanopartiklar och införlivades därefter i en HA-PLGA-bilageblandningsfilm med en diameter på 33 mikrometer, som fullständigt bröts ned och absorberades helt och hållet på 12 veckor . Även kombinerade makroporösa bioresorberbara membran för benläkning tillverkades av en kombination av poly-mjölksyra-co-glykolsyra-co-ε-caprolakton (PLGC) . I en 6-månadersstudie på hundkäke användes olika PLGC-membran ensamma eller förstärkta med titan, och alla uppvisade mer ben än kontrollerna, även om membranen användes ensamma eller tillsammans med autologt ben . I nyligen genomförda studier användes PLGA-membran som behandlades med syreplasma och med SiO2-nanopartiklar som lyckades främja 59 % nybildning av ben i mycket högre grad än enbart PLGA-membran, i ett nyligen genomfört experiment på kaniners skalle.
Andra studier inriktade sig på in vivo-beteendet hos olika membran, t.ex. kollagen, polylaktid/polyglykolid-copolymer och citronsyra-copolymer. Resultaten visar inga statistiska skillnader mellan dessa membran . Dessutom ledde PGA/PLA-membranet av polyglykolsyra/polymjölksyra-sampolymer till relativt likartade resultat jämfört med tillämpningen av kollagenmembran . Dessutom observerades inga statistiskt signifikanta skillnader när bindvävstransplantat användes i stället för PLGA-membranen , vilket tyder på att bättre resultat uppnåddes när hydroxyapatit tillsattes till polymermembranen . I en nyligen genomförd studie på 40 patienter drogs slutsatsen att PLGA-membranet framgångsrikt kunde bedöma benregenerering, men kontrollen visade bättre resultat när det gällde att bibehålla den horisontella tjockleken på det regenererade benet och avslöjade färre komplikationer i mjukvävnaden . Sammantaget verkar processen att tillsätta benfrämjande faktorer eller andra material till PLGA-membranen förbättra resultaten vid regenerering av benvävnad.
4. PLGA-ställningar
PLGA-ställningar används för närvarande som fristående biomaterial, cellbärare eller anordningar för läkemedelstillförsel . Forskning inom medicin drar nytta av utvecklingen av PLGA-ställningar som grundar många potentiella tillämpningar inom områden som regenerering av hjärtvävnad , sårläkning , styrd benregenerering av benvävnad , leverans av tillväxtfaktorer och gener och odling av stamceller . Under de senaste åren har många insatser inom benvävnadsteknik ägnats åt att utveckla biologiskt nedbrytbara ställningar med både utmärkt biokompatibilitet och mekaniska egenskaper som efterliknar dem hos naturliga benvävnader . PLGA-ställningar har använts för att regenerera skadade vävnader, t.ex. vid benbildning eller regenerativ tandvård, tillsammans med stamcellsbaserad terapi . I tabell 2 visas studier om tillämpningar av PLGA-ställningar vid benläkning och benregenerering. Benbildning har erhållits med PLGA-plastbärare som införlivats med autogent bentransplantat eller olika benfrämjande substanser, t.ex. benmorfogenetiskt protein-2 BMP-2 eller simvastatin . Alveolärkammen, som är mycket nödvändig vid tandimplantatbehandling, kunde också gynnas av PLGA-materialen, eftersom atrofiska områden rekonstruerades med hjälp av bioresorberbart PLGA, benallogranat och ett osteoinduktivt protein som rhBMP-2 . Fickorna var betydligt större hos råttor som behandlades med PLGA/PEG1 efter extraktion, efter endast fyra veckors implantation . Även PLGA-ställningar laddade med simvastatin och SDF-1α främjade benregenerering betydligt mer än kontroller i kalvarialdefekter hos möss . Dessutom visade tillägget av rekombinanta humana benmorfogenetiska proteiner till PLGA-gelatinsvampsställningar en betydligt större benbildning utan immunförsvar eller andra biverkningar vid alveolärkammaraugmentation hos hundar .
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Komposit PLGA/CaP-ställningar har också tillämpats i förfaranden för benregenerering (ensamma eller i kombination med osteoblastceller ). PLGA/CaP (kalciumfosfat) tvåskiktat biomaterial användes med större parodontal regeneration i klass II furkationsdefekter hos hundar än traditionella flexibla membran, som visade större benvolymvärden, trabekulärt antal och trabekulär tjocklek . Förutom PLGA/CaP har andra kompositer, t.ex. PLGA/apatitställningar och PLGA/β-trikalciumfosfatställningar, visat sig vara bioeffektiva för benbildning . Betydligt mer cement och ben bildades i parodontala defekter hos hundar efter behandling med rhGDF-5 belagt på beta-trikalciumfosfatpartiklar (beta-TCP) och nedsänkt i en bioresorberbar komposit av poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) . Dessutom användes PLGA-ställningar ensamma eller i kombination med celler vid förstärkning av bihålor i käkarens bihålor . Benregeneration uppnåddes genom utsäde av mesenkymala stamceller från benmärg eller stamceller från tandpulpan på PLGA-ställningar . Dessutom har PLGA/hydroxyapatit-ställningar visat sig främja cellproliferation och differentiering av stamceller . Ben regenererades också med hjälp av en PLGA/hydroxyapatit-ställning med utsäde av dedifferentierade fettceller eller PLGA-kalciumfosfatställning med benmärgsstamceller . Tillsatsen av benmärgsstamceller till PLGA-kalciumfosfatställningar visade 20 gånger mer benbildning än enbart ställningar.
Polymermaterial har använts som ställningar för att styra dentala stamceller med målet att skapa tandliknande strukturer. PLGA-material har använts vid regenerering av dentin eller för att skapa dentinliknande strukturer . Forskare kunde såda och odla stamceller från tandmassa på PLGA-ställningar, och dessa ställningar transplanterades i kaniner och verkade producera osteodentinliknande strukturer samt tubulära tvåskiktsstrukturer av vertikalt inriktade parallella tubuli som liknar tubulärt dentin . Dessutom gav PLGA/trikalciumfosfat med tandknoppsceller upphov till dentinliknande och pulpa-liknande vävnader . Stamceller från tandmassan hos svin såddes på PLGA-ställningar och implanterades i råttkanaler från extraherade tänder, som placerades i färska fästen efter extraktion hos minigrisar . Efter 10 veckors implantation visade den histologiska analysen att nybildad organisk matris konsekvent avsattes på kanalväggarna och att det fanns ett kontinuerligt skikt av polariserade eller opolariserade celler med kolonn- eller spindelformad morfologi . Stromaceller från fettvävnad på en PLGA-ställning regenererade också ben, parodontalligament och cementlager . Tabell 3 visar de viktigaste tillämpningarna av PLGA-ställningar inom regenerativ tandvård.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Och även om de visar lovande resultat i en rad olika tillämpningar är PLGA-ställningars biokompatibilitet omdebatterad. Nedbrytningsprodukterna av PLGA (mjölksyra och glykolsyra) kan sänka pH-värdet i de omgivande vävnaderna, vilket kan orsaka inflammation eller främmande kroppsreaktioner in vivo . De sura nedbrytningsprodukterna kan också hämma bildningen av apatitkristaller, vilket förmodligen leder till bristande osteointegration. De hydrofoba egenskaperna hos de bioresorberbara polyestrarna påverkar deras celladhesion negativt . I ett försök att minska inflammationen och förbättra PLGA:s biokompatibilitet har dessutom olika partiklar införlivats med lovande resultat i PLGA-materialen: titannanopartiklar, tripolyfosfatnanopartiklar, partiklar av demineraliserat ben och nanoapatitpartiklar . PLGA-ställningar har också funktionaliserats med fibronectin och PLGA-fibrerna har belagts med apatitskikt. Ett annat problem är det faktum att aeroba och anaeroba mikroorganismer från saliven fastnade betydligt mer på PLGA jämfört med andra polymera ställningar (PLLA och PLLA-TCP). E. faecalis (en bakterie som förekommer vid återkommande endodontiska infektioner) och P. gingivalis (en patogen som är relaterad till parodontit) uppvisade den högsta vidhäftningen till PLGA-ställningen, vilket ger upphov till oro för eventuella implantatrelaterade infektioner .
5. PLGA-mikropartiklar
Konceptet att använda polymerbaserade system för långvarig frisättning för att bibehålla terapeutiska läkemedelskoncentrationer under längre tidsperioder har accepterats i årtionden . Mikropartiklar och nanopartiklar är att föredra framför andra metoder på grund av deras flexibilitet vid beredning och användning . Flera medicinska tillämpningar av PLGA-mikropartiklar omfattar genleverans , cancerbehandling och vacciner . PLGA-mikropartiklar har framgångsrikt studerats inom ett stort antal tandvårdsområden, t.ex. endodontiterapi, kariesvaccinering, regenerativ tandvård, tandkirurgi och parodontologi . I tabell 4 sammanfattas de viktigaste tillämpningarna av PLGA-mikropartiklar inom tandvården.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
I endodonti kunde PLGA- och zein-mikrosfärer leverera amoxicillin på betydande nivåer i rotkanalen och övervinna de koncentrationsnivåer som krävs för en lämplig endodontisk desinfektion . Amoxicillin valdes eftersom det är effektivt mot Enterococcus faecalis, en mikroorganism som är ansvarig för endodontiskt misslyckande och som är mest resistent mot rotkanalpreparering och intrakanala förband . Dessutom kan PLGA-mikrosfärer som innehåller rekombinant Streptococcus mutans glukanbindande protein D (rGbpD) ge upphov till ett framtida tandvaccin, vilket framgår av en studie på immuniserade råttor som behandlats med kitosanbelagda PLGA-mikrosfärer. Tillväxtfaktorer som ingår i PLGA-mikrosfärer inducerar bildandet av tertiär dentin , medan trombinladdade poly(D,L-lactid-co-glykolid)-mikrosfärer bildar en ny biologiskt nedbrytbar blodstillande anordning . Parodontologin kan också dra nytta av PLGA-mikropartiklarnas egenskaper när det gäller kontrollerad leverans. En mängd olika ämnen har införlivats i PLGA-bärarna och långsamt frigjorts lokalt för parodontal behandling och regenerering: tetracyklin , doxycyklin eller klorhexidin . PLGA-mikrosfärer med hydroxyapatit och ofloxacin tillverkades för att användas som ett lokalt system för läkemedelstillförsel för parodontitbehandling och visade goda resultat mot S. aureus och E. coli , medan PDLLA-PLGA-mikropartiklar fyllda med tillväxt- och differentieringsfaktorer kunde påskynda osteogenes, benmognad, fibrer och cementogenes av parodontalapparaten i råttors överkäkar. Benregenerering är det dentala område som de flesta studierna om PLGA-mikropartiklar är inriktade på. Intracellulär leverans av östrogen (en könssteroid som ökar benbildningen) med hjälp av katjoniska PLGA-mikropartiklar uppreglerar avsevärt den osteogena differentieringen av mesenkymala stromaceller från mänsklig benmärg genom att förbättra uttrycket av de osteogena differentieringsmarkörerna ALP och Cbfa-1 efter 1 och 2 veckor . PLGA-mikrosfärer som innehåller simvastatin , tillväxtfaktorer eller dexametason förbättrade signifikant benbildningen. PLGA-mikropartiklar laddade med tillväxtfaktorer användes också för bättre osteointegration av titanimplantat, medan PLGA-mikrosfärer med bifosfonat kan användas i framtiden för att behandla alveolär benresorption . Injicerbara PLGA-mikrosfärer innehållande fluvastatin utvecklades för att förbättra osteogenesen kring titanimplantat i skenbenet hos råttor och efter en enda injektion stimulerade PLGA-mikrosfärerna med fluvastatin på ett säkert sätt benbildningen kring titanimplantat och ökade benets mekaniska egenskaper . Den biomekaniska bibehållningen av implantat förbättrades efter tillsats av PLGA-mikropartiklar laddade med insulin, enligt en djurstudie på typ I-diabetiska råttor . Dessutom användes PLGA-mikropartiklar för bättre osseointegration av titanimplantat, även hos diabetiska råttor av typ II, eftersom insulinliknande tillväxtfaktor I långsamt frigjordes i 30-40 dagar av PLGA-mikropartiklar och ledde till benavlagring runt titanimplantatens gränssnitt . En ställning med PLGA-mikropartiklar laddade med ett benmorfogenetiskt protein (rhBMP-2) var effektivare för att framkalla osseointegration av implantat än samma ställning med proteinet direkt inkapslat utan PLGA-mikropartiklar . Användningen av mikropartiklar gav också upphov till flera praktiska problem. När partiklarna studerades vid implantatbehandlingar rapporterade vissa författare att PLGA-läkemedel förlorades under implantatplaceringen. Olika tillvägagångssätt, t.ex. att föra in blod blandat med PLGA-mikrosfärer i implantathålet eller att tillsätta blodet blandat med PLGA på titanimplantaten , visade en betydande förlust av PLGA-mikropartiklar på grund av den mekaniska friktionen.
Den stora mängden dentala tillämpningar där PLGA-partiklar kan användas är uppmuntrande. De lovande resultaten inom området benregeneration och parodontologi kan behöva ytterligare studier och kliniska prövningar. Sammantaget verkar mikropartiklar av polymjölks- och polyglykolsyror vara en lovande kontrollerad leveransanordning vid tandbehandling.
6. PLGA-nanopartiklar
Mikropartiklar och nanopartiklar utformas huvudsakligen som riktade system för läkemedelstillförsel i syfte att minimera de bieffekter som är förknippade med användningen av de fria läkemedlen. Olika termer har använts för att beskriva nanopartiklar: nanotransporter, nanoviklar, nanosystem, nanodisk, nanovorm, nanorod, nanorör, konjugat av läkemedel och polymerer, konjugat av läkemedel och protein, liposomer, polymermikeller, dendrimerer och nanokristaller av läkemedel . Nanopartiklar ger ett stort antal fördelar, t.ex. mindre partikelstorlek som underlättar inträngningen i cellerna, högre inlåsningseffektivitet för ökad frisättning av läkemedel, lägre lägsta hämmande koncentration och lägsta bakteriekoncentration, vilket innebär att en bättre antibakteriell aktivitet uppnås med en mindre mängd läkemedel . På det medicinska området har PLGA-nanopartiklar utvecklats som genbärare, och de har också studerats ingående som system för vaccinleveranser eller i cancerbehandling. Målinriktade PLGA-nanopartiklar, men inte mikropartiklar, levererar specifikt antigen till mänskliga dendritiska celler.
Nanopartiklar av PLGA kan användas i en mängd olika tillämpningar inom tandvården, vilket visas i tabell 5. Minocyklinladdade PLGA-nanopartiklar visade bättre antibakteriell aktivitet än användning av fritt minocyklin och kan utgöra ett potentiellt bärarsystem för transport av antibiotika till parodontala vävnader. Inhibitionszonen för minocyklinladdade nanopartiklar (9,2 mm) var större än för fritt minocyklin (3,5 mm) mot Aggregatibacter actinomycetemcomitans, den viktigaste patogenen vid parodontala infektioner . Dessutom visade metylenblå laddade PLGA-nanopartiklar en större fotodynamisk effekt än fri MB och uppvisade ungefär en storleksordning av dödande av E. faecalis biofilm species (en mikroorganism som finns i endodontiska misslyckanden) i experimentellt infekterade rotkanaler av extraherade tänder från människor . PLGA-nanopartiklar laddade med metylenblått uppvisade också en större fotodynamisk effekt än fritt MB i suspensioner av bakterier från mänskligt tandplack samt i biofilmer som samlats in från 14 patienter med kronisk parodontit . PLGA-nanopartiklar laddade med metylenblå fotosensibilisator kan alltså användas vid endodontiska infektioner och för att minska antalet bakterier i tandplack hos patienter med kronisk parodontit. Dessutom bidrar PLGA-nanopartiklar till betydande förbättringar av tekniker för benregenerering genom att leverera tillväxt- och differentieringsfaktorer med lovande resultat. Leverans av PLGA-nanopartiklar laddade med benmorfogenetiskt protein-2 till mesenkymala stamceller från benmärgen gav upphov till en mycket mer omfattande benbildning in vivo än antingen implantation av nanopartiklar laddade med enbart BMP-2 eller osteogeniskt differentierade stamceller . PLGA-nanopartiklar som innehåller simvastatin användes också för att öka osteogenesen hos benmärgsmesenkymala stamceller, som kan användas vidare för benregenerering . Nanopartiklar av PLGA med tillväxtfaktor har också använts med framgång inom implantatterapi för att stimulera benbildningen intill ytan på ett tandimplantat som satts in i benet . Den histomorfometriska analysen visade en genomsnittlig kontaktprocent mellan ben och implantat på 44 % efter endast 12 veckors implantation i tibiae av kanin. De resultat som erhållits i dessa studier är lovande, men det krävs ytterligare experiment för att testa effekterna av att använda nanopartiklar av PLGA i tandbehandlingar.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
7. PLGA Begränsningar
Slutsatsen är att PLGA-membranen hittills har kontroversiella resultat när de används ensamma i terapi för benregenerering . Vissa författare föreslog att PLGA har begränsade positiva effekter vid ben- och parodontal regeneration. Dessutom verkar orala mikroorganismer (t.ex. S. mutans, E. faecalis, P. nigrescens, P. gingivalis, S. sanguis och C. albicans) ha en god vidhäftning till PLGA-ställningar in vitro och detta kan leda till bakterierelaterade infektioner in vivo . Forskningen bör intensifieras och utvidgas för att övervinna de praktiska problem som uppstått vid hanteringen av PLGA-mikropartiklar . Vi måste också ta hänsyn till de otillräckliga uppgifterna om PLGA-nanopartiklar inom tandvården.
8. Slutsatser
På grund av deras biokompatibilitet har PLGA-material framgångsrikt studerats inom nästan alla tandvårdsområden, från endodonti till parodontologi och implantologi. De lovande resultaten av in vitro- och in vivo-experimenten tyder på att ytterligare studier om PLGA-tillämpningar bör genomföras inom den dentala forskningen.
Intressekonflikter
Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter i samband med publiceringen av denna artikel.
Acknowledgments
Bogdan Calenic bekräftar att denna artikel delvis stöds av det sektoriella operativa programmet för utveckling av mänskliga resurser (SOPHRD), som finansieras av Europeiska socialfonden och den rumänska regeringen enligt kontrakt nr. POSDRU 141531. Daniela Miricescu vill tacka Young Scientist Grant 2014-2016 från University of Medicine and Pharmacy Carol Davila, Bukarest, Rumänien. Maria Justina Roxana Virlan bekräftar att denna artikel delvis stöds av det sektoriella operativa programmet för utveckling av mänskliga resurser (SOP HRD), som finansieras av Europeiska socialfonden och av den rumänska regeringen enligt kontrakt nr. SOP HRD/159/1.5/S/135760.