Resten på den aktiva platsen, His(15), i histidininnehållande protein, HPr, kan ersättas med aspartat och fortfarande fungera som fosfoacceptor och fosfodonor med enzym I respektive enzym IIA(glukos). Andra substitutioner, inklusive cystein, glutamat, serin, treonin och tyrosin, visade ingen aktivitet. Enzym I K(m) för His(15) –> Asp HPr ökar 10 gånger och V(max) minskar 1000 gånger jämfört med vildtyp HPr. Fosforyleringen av Asp(15) ledde till en spontan intern omarrangemang med förlust av fosforylgruppen och en vattenmolekyl, vilket bekräftades med masspektrometri. Den proteinart som bildades hade ett högre pI än His(15) –> Asp HPr, vilket kan bero på bildandet av en succinimid eller en isoimid. Hydrolys av den isolerade formen med högt pI gav endast asparaginsyra vid rest 15, och ingen isoasparaginsyra påvisades. Detta tyder på att en isoimid snarare än en succinimid bildas. I avsaknad av fosforylering kunde ingen bildning av den höga pI-formen hittas, vilket tyder på att fosforylering katalyserade bildandet av cykliseringen. Den möjliga inblandningen av Asn(12) i en intern cyklisering med Asp(15) eliminerades genom mutationen Asn(12) –> Ala i His(15) –> AspHPr. Asn(12)-substitutioner av alanin, aspartat, serin och threonin i HPr av vildtyp indikerade ett generellt krav på rester som kan bilda en vätebindning med Nepsilon(2)-atomen i His(15), men eliminering av vätebindningen har endast en 4-faldig minskning av k(cat)/K(m).
Organisatorisk tillhörighet: 
Avdelningen för biokemi, University of Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan S7N 5E5, Kanada.
Dölj fullständigt sammandrag