Un rol critic al CD29 și CD49f în medierea metastazelor pentru celulele de inițiere a cancerului izolate dintr-un model de cancer de sân asociat cu Brca1-…asociat cu un model de șoarece de cancer de sân

CSC-urile din celulele canceroase Brca1-mutante mediază migrația celulară in vitro

Am izolat anterior celule CD24+CD29+ și CD24+CD49f+ care sunt îmbogățite pentru celule inițiatoare de cancer sau CSC-uri din tumori mamare primare dezvoltate la șoareci Brca1-mutanți sau dintr-o linie celulară cultivată, (W0069), care a fost obținută dintr-o tumoare mamară Brca1.39 Pentru a testa rolul acestor celule în metastaze, am sortat celulele CD24+CD29+ (care vor fi numite CSC) și celulele CD24-CD29- (non-CSC) din linia celulară W0069, care conține aproximativ 15 % de celule CD24+CD29+, așa cum s-a arătat anterior,39 și am investigat capacitatea de migrare utilizând atât testul de vindecare a rănilor, cât și testul transwell. După 24 de ore, celulele CD24/CD29 dublu pozitive au prezentat o capacitate de migrare mai bună în comparație cu celulele dublu negative, așa cum reiese din dimensiunea rănilor (figura 1a). Testul de migrare transwell a evidențiat, de asemenea, o diferență semnificativă în ceea ce privește numărul de celule migrate atât la suprafața inferioară a filtrului (175,6±19 față de 54,2±18,1, **P<0,01), cât și în camera inferioară a transwell-ului (82,3±5,5 față de 4,3±2,1 colonii, **P<0,01) (figura 1b) (Figura 1b). Rezultate similare au fost obținute atunci când am investigat diferite subclone derivate din aceeași linie celulară, fie pozitive, fie negative pentru prezența CSC-urilor (datele nu sunt prezentate). Pentru a confirma faptul că CSC-urile au o motilitate crescută, am amestecat diferite cantități de celule W0069 cu celule dublu-negative sortate din linia celulară W0069. După cum se arată în figura 1c, capacitatea de migrare a scăzut odată cu scăderea numărului de celule dublu pozitive, deși numărul total de celule utilizate a rămas stabil prin creșterea numărului de celule CD24-CD29-. Începând cu 5 × 104 celule W0069, am constatat că celulele migrate au format 52,6±15,5 colonii în camera inferioară. Atunci când 4 × 104 celule W0069 au fost amestecate cu 1 × 104 celule dublu-negative, numărul de colonii a fost redus la 16±2,6. Numărul de colonii a scăzut și mai mult atunci când am continuat să reducem numărul de celule W0069 și să creștem numărul de celule CD24-CD29- (figura 1c). Aceleași rezultate au fost obținute atunci când celulele W0069 au fost amestecate cu o subclonă (W0069-202), care are numai celule CD24-CD29- (Figura suplimentară 1a și b). Dimpotrivă, am demonstrat că numărul de colonii a crescut atunci când numărul de celule CD24+CD29+ utilizate a fost crescut treptat (Figura suplimentară S1c). Pentru a verifica în continuare rolul CSC-urilor în migrație, au fost utilizate celule marcate cu proteină fluorescentă verde W0069, pozitive pentru prezența CSC-urilor, și au fost amestecate cu celule CD24-CD29- neetichetate sortate. Prin creșterea numărului de celule pozitive, am observat o creștere a numărului de colonii formate de celulele migrate, iar toate coloniile formate au fost verzi atunci când au fost verificate la un microscop cu fluorescență, ceea ce implică faptul că migrația poate fi observată numai atunci când în cultura celulară sunt prezente celule CD24+CD29+ (Figura 1d și e). Împreună, aceste date sugerează că CSC-urile prezintă o motilitate sporită în liniile celulare canceroase cu mutație Brca1.

CSC-urile din cancerul cu mutație Brca1 mediază metastazele cancerului in vivo

În continuare, am evaluat rolul potențial al CSC-urilor în metastazele in vivo. Celulele CD24+CD29+ și CD24-CD29- proaspăt sortate, precum și subclonele pozitive sau negative pentru aceiași markeri din linia celulară W0069 au fost implantate în glanda mamară a șoarecilor athimici virgini (nude) în vârstă de 6-8 săptămâni. În primul rând, am observat că creșterea tumorii a fost mai lentă atunci când celulele CD24-CD29- sortate au fost comparate cu celulele CD24+CD29+ (Figura 2a și b), ceea ce este în concordanță cu ideea că această populație se îmbogățește pentru CSC.39 Rezultate similare au fost obținute atunci când au fost utilizate subclonele pozitive sau negative pentru prezența CSC (datele nu sunt prezentate). Deși șoarecii injectați cu celule CD24+CD29+ au trebuit să fie uciși mai devreme (ziua 49-54) decât șoarecii injectați cu celule CD24-CD29- (ziua 60-69) din cauza încărcăturii tumorale mai mari, a existat o creștere semnificativă a prezenței metastazelor în grupul de șoareci injectați cu celule CD24+CD29+. În special, 3/15 șoareci implantați cu linii celulare negative prezentau câte un mic nodul tumoral în plămân pentru fiecare șoarece (Figura 2c și d). În schimb, s-a constatat că 13/18 șoareci implantați cu linii celulare pozitive posedau noduli metastatici în plămâni, cu un total de peste 100 de noduli (acest număr ar putea fi subestimat deoarece dimensiunea majorității nodulilor era mult mai mare, iar nodulii nu au putut fi numărați cu precizie atunci când erau prea mulți într-un singur plămân) (Figura 2c și d). Deoarece a existat o diferență de aproximativ șapte ori (5000mm3/700mm3) în ceea ce privește dimensiunea tumorii primare între tumorile pozitive și cele negative, am luat în considerare posibilitatea ca diferența în ceea ce privește metastazele să fie atribuită diferenței de creștere a tumorii. Cu toate acestea, se știe că metastazele tumorale încep în stadii de inițiere, atunci când tumorile sunt mici, mai degrabă decât în stadii târzii, atunci când sunt mari40 , ceea ce contrazice această posibilitate. Mai mult decât atât, diferența în ceea ce privește numărul de noduli este de aproximativ 33 de ori (100/3) și majoritatea nodulilor derivați din celulele dublu pozitive sunt mult mai mari decât cei proveniți din celulele dublu negative, ceea ce evidențiază capacitatea metastatică diferită a celor două subpopulații. În ceea ce privește originea celor trei noduli metastatici, este posibil ca populația dublu-negativă să conțină încă unele celule care au capacități mai reduse de inițiere a cancerului și de metastază. Alternativ, unele celule CD24-CD29- ar putea dobândi aceste abilități prin de-diferențiere. Acestea sunt aspecte interesante care merită investigate în continuare.

CD29 și CD49f au un rol critic de mediere a metastazelor canceroase

În mod interesant, profilarea acestor tumori metastatice prin analiza de sortare celulară activată prin fluorescență folosind markeri CD24 și CD29 a arătat că cele provenite din liniile celulare dublu pozitive au avut un profil similar cu cel al tumorilor primare sau al liniei celulare canceroase originale (figura 3a, stânga). Deoarece numai CSC-urile din cadrul tumorii pot recapitula eterogenitatea tumorii originale, acest lucru indică faptul că CSC-urile metastatizează și conduc formarea tumorilor metastatice. În schimb, în tumorile derivate din liniile celulare negative nu au fost detectate celule dublu-pozitive CD24 și CD29 chiar și după ce acestea au metastazat (Figura 3a, dreapta), așa cum a arătat analiza de sortare celulară activată prin fluorescență. Mai mult, am reușit să detectăm celule CD24+CD29+ prin colorare prin imunofluorescență în noduli metastatici în plămân din tumorile inițiate prin implantarea cu celule CD24+CD29+ (figura 3b), dar nu și din tumorile inițiate prin implantarea cu celule CD24-CD29- (date neevidențiate). În concordanță cu observația conform căreia celulele CD24+CD29+ au o mobilitate mai mare decât celulele CD24-CD29-, colorarea cu anticorpi împotriva CD24 și CD29 a detectat, de asemenea, celule CD24+CD29+ în celulele care migrează în timpul testului de cicatrizare a rănilor (figura 3c). Aceste rezultate susțin ideea că CSC-urile prezintă o motilitate sporită atât in vitro cât și in vivo și au un rol crucial în stimularea capacității metastatice a tumorilor mamare cu mutație Brca1.

Atât CD29 (β1 integrin), cât și CD49f (α6 integrin) sunt subunități de integrin, care servesc ca receptori ai matricei extracelulare. 41 Deoarece matricea extracelulară este implicată în mobilitatea celulară și în metastaza cancerului,41 am fost interesați să determinăm dacă CD29 și CD49f servesc doar ca markeri pentru CSC-uri sau dacă au de fapt un rol critic în medierea metastazelor cancerului. În primul rând, am eliminat CD29 în celulele W0069 și CD24+CD29+ folosind un ARN de interferență mică (siRNA) individual care vizează cadrul de citire deschis al CD29, iar datele noastre au evidențiat o migrație celulară notabilă, dar nu diminuată din punct de vedere statistic, a celulelor siCD29 în comparație cu celulele de control (Figura 4a și b). Deoarece CD29 și CD49f formează heterodimeri, am suspectat că CD49f ar putea compensa unele funcții atunci când expresia CD29 a fost afectată. Pentru a investiga acest lucru, în continuare am eliminat CD49f prin siRNA în aceste celule (Figura 4a). Datele noastre au indicat că reducerea CD49f singur a redus, de asemenea, ușor capacitatea de migrare a celulelor la niveluri similare celor observate în celulele tratate cu siCD29 (Figura 4b). Cu toate acestea, s-a observat o reducere marcată a migrației celulare, dar nu și a viabilității celulare, atunci când ambele au fost eliminate în același timp (Figura 4a-d). Aceleași rezultate au fost obținute prin utilizarea unui grup de siARN-uri împotriva a patru regiuni diferite din cadrul de citire deschis al acestor gene (Figura suplimentară 2a-c). Am verificat, de asemenea, expresia a patru integrine înrudite (integrinele α5 și 7 și integrinele β2 și 3) după ce am eliminat CD29 și CD49f, iar datele indică faptul că aceste siARN-uri nu au modificat expresia altor integrine, excluzând activitatea de inhibiție încrucișată a acestor siARN-uri față de alte integrine (Figura suplimentară 2d). În ansamblu, aceste constatări implică faptul că integrinele α6 și β1 pot avea un rol funcțional suprapus, dar critic, în migrația CSC-urilor. Astfel, prin sortarea celulelor folosind integrinele α6 și β1 ca markeri, îmbogățim de fapt celulele în care aceste proteine pot avea un rol funcțional în medierea migrației celulare in vitro și a metastazelor canceroase in vivo.

CSC-urile au prezentat o semnătură de expresie a genelor de tranziție de la epiteliu la mezenchimal

Pentru a înțelege mecanismul care stă la baza capacității metastatice sporite a CSC-urilor, am efectuat analize morfologice și moleculare atât pe celulele CD24+CD29+, cât și pe CD24-CD29-. Analiza noastră a indicat faptul că celulele CD24-CD29- prezentau E-cadherină legată de membrană mai proeminentă, un marker pentru celulele epiteliale, decât celulele CD24+CD29+ (figura 4e). Analiza qRT-PCR a detectat, de asemenea, niveluri mai ridicate de expresie a E-cadherinei în celulele CD24-CD29- decât în celulele CD24+CD29+ (figura 4f). În concordanță cu nivelurile reduse de expresie a E-cadherinei, celulele CD24+CD29+ au prezentat, de asemenea, niveluri mai ridicate de expresie a mai multor gene marker pentru celulele mezenchimale, așa cum a fost evidențiat prin qRT-PCR (Figura 4f) și prin analiza Western Blot (Figura suplimentară 2e). Deoarece ambele tipuri de celule au fost derivate dintr-un carcinom ductal mamar, caracteristica mezenchimală sporită a celulelor CD24+CD29+ sugerează că acestea au suferit o tranziție de la epitelial la mezenchimal, ceea ce oferă o bază moleculară pentru motilitatea lor crescută in vitro și pentru metastazele canceroase in vivo.

În rezumat, am studiat potențialul metastatic al CSC-urilor îmbogățite în populația de celule CD24+CD29+ izolate dintr-un model de șoarece Brca1-mutant de cancer de sân, iar datele noastre au indicat că CSC-urile au prezentat o capacitate de migrare mult mai mare decât non-CSC-urile în cultura de țesuturi și un potențial metastatic sporit la șoarecii alogrefăcuți. Am demonstrat că celulele CD24+CD29+ au păstrat capacitatea de a se diferenția și de a reconstitui eterogenitatea în tumorile metastatice, în timp ce celulele CD24-CD29- nu au putut. Cu toate acestea, o constatare foarte interesantă este aceea că CD29 și CD49f, care au fost utilizați ca markeri pentru izolarea CSC-urilor din tumorile mamare de șoarece39, 42, 43, au un rol suprapus, dar esențial în medierea migrației CSC-urilor. La șoareci, β1-integrina reprezintă integrina predominant exprimată în celulele epiteliale mamare și are un rol critic în progresia cancerului.44 În timp ce în cancerele mamare umane, α6-integrina este exprimată la niveluri ridicate și servește ca factor de prognostic independent, așa cum a relevat un studiu cu un efect dependent de timp limitat la primii 2 ani de urmărire.45 Cu toate acestea, rolul potențial al ambelor gene în CSC-urile din cancerele mamare rămâne evaziv. Datele noastre au indicat că afectarea funcției integrinei β1 sau a integrinei α6 singură are ca rezultat un efect mult mai blând decât eliminarea simultană a ambelor gene. Această constatare este în concordanță cu faptul că ambele integrine se pot împerechea una cu cealaltă pentru a forma heterodimeri pentru componentele matricei extracelulare, cum ar fi fibronectina și laminina.41, 46, 47, 47, 48, 49 S-a sugerat că o rețea socială malignă mediază adeziunea celulă-celulă și comunicarea dintre CSC și micro-mediul lor.20, 21 Studiul nostru implică un rol important al integrinelor β1/α6 în medierea acestei rețele. În mod specific, integrinele β1/α6 pot media interacțiunea CSCs-stroma, retransmițând semnalizarea matricei extracelulare către mașinăria celulară și conducând la o activitate sporită a CSCs în ceea ce privește viabilitatea, diferențierea și metastazarea.

.