Testul clonogenic a fost utilizat în numeroase studii pentru a cuantifica creșterea clonogenică și abrogarea acesteia prin stimuli citotoxici, inclusiv radiații, medicamente chimioterapeutice și/sau agenți cu țintă moleculară, in vitro. Procedura standard actuală de determinare a fracțiilor de supraviețuire se bazează pe ipoteza că creșterea clonogenică în culturile de celule tratate poate fi normalizată față de martorii netratați prin împărțirea la o constantă PE specifică liniei celulare.
Demonstrăm aici, totuși, că acest lucru nu este universal aplicabil. Dimpotrivă, datele noastre indică în mod clar că corelația dintre numărul de celule însămânțate într-un vas de cultură și numărul de colonii obținute este departe de a fi întotdeauna liniară. În cazul liniilor celulare cu comportament cooperant, analiza bazată pe PE a datelor de supraviețuire clonogenică a dat rezultate cu erori intrinseci de la mari la enorme. Chiar dacă pentru analiză au fost utilizate numai vase de cultură cu un număr rezonabil de colonii (C = 5 până la 100), fracțiunile de supraviețuire clonogenică la o anumită doză diferă cu mult mai mult de un ordin de mărime pentru liniile celulare cu grade ridicate de cooperare celulară. De remarcat, practic orice curbă de supraviețuire (abruptă sau plată, moderat sau puternic curbată, liniară, pătratică sau neregulată) poate fi derivată din această gamă de rezultate calculate din setul de date dat – o observație care ar putea avea o importanță deosebită pentru biologii în domeniul radiațiilor.
Consumate, datele noastre arată că analiza convențională bazată pe PE a datelor de supraviețuire clonogenică funcționează necorespunzător de îndată ce apare cooperarea celulară în una sau mai multe condiții în cadrul unui experiment, iar rezultatele de supraviețuire extrase vor varia într-un interval nesatisfăcător de mare. În mod specific, rezultatele vor fi puternic distorsionate dacă sunt placate doar una sau câteva densități celulare similare. Această practică generează erori intrinseci ale testului, care sunt o consecință directă a densităților celulare alese și, prin urmare, nu se pretează la analize statistice ale erorilor. În cazul liniilor celulare care cresc în mod cooperativ, observațiile noastre pot explica parțial neconcordanțele raportate între teste, între cercetători și între laboratoare în ceea ce privește datele privind răspunsul la tratament. O meta-analiză a datelor de testare a formării de colonii A549 susține și mai mult această ipoteză: În cadrul unui panel de 156 de studii diferite, Nuryadi et al. au raportat valori SF4 pentru această linie celulară specifică variind de la 5 la 90 %, cu un interval interquartil SF4 de peste 25 % . Deși diverși alți parametri pot influența cu siguranță datele privind răspunsul la tratament, concluzionăm din datele noastre că cooperarea celulară este un factor major care explică variabilitatea dintre studii. Deoarece chiar și diferențele mici în ceea ce privește fracțiile de supraviețuire clonogenică pot încuraja cercetătorii să postuleze și să studieze noi ipoteze științifice care ar putea, în cele din urmă, să se bazeze pe o precizie falsă, am dezvoltat o nouă abordare de analiză care este mai puțin sensibilă la impactul densității celulare – în special, dar nu numai, pentru liniile celulare cu creștere cooperativă. Această metodă ține cont de relațiile neliniare dintre numărul de celule însămânțate și numărul de colonii obținute prin punctarea vaselor de cultură cu o gamă largă de numere de celule însămânțate pentru toate condițiile de tratament.
Matematic, abordarea noastră utilizează regresia puterii și interpolarea numerelor de colonii potrivite la diferite doze de iradiere. Aplicată aceluiași set de date care a fost utilizat pentru calculele bazate pe PE, aceasta a furnizat rezultate clar mai stabile, independente de densitatea celulară. Cititorii atenți ar fi putut observa că calculele fracției de supraviețuire efectuate conform metodei prezentate aici se bazează exclusiv pe coeficientul a și exponentul b extrase prin regresia puterii. Deși acest lucru compensează în mod evident efectele cooperării celulare, acesta poartă o altă calitate a erorii care derivă din inexactitatea regresiei și care nu poate fi comparată cantitativ cu calitatea similară a erorii din calculele fracției de supraviețuire bazate pe PE. În consecință, această eroare ar trebui să fie minimizată prin asigurarea unui design experimental atent, cu un număr suficient de replici independente. Mai mult, calculele fracției de supraviețuire ar trebui efectuate numai cu rezultate de regresie de putere cu performanțe corespunzătoare, așa cum indică coeficientul de regresie R.
Abordarea noastră matematică înlocuiește practic calculele de supraviețuire clonogenică bazate pe PE cu întrebarea:
De câte ori trebuie însămânțate mai multe celule într-o farfurie de cultură tratată pentru a obține un număr identic de colonii ca într-o farfurie de control?
Exponentul b are o importanță deosebită în această privință. Acesta indică dacă corelația dintre numărul de celule însămânțate și numărul de colonii numărate este liniară (b ≈ 1) sau nu. Valorile ridicate ale lui b, așa cum au fost obținute pentru celulele BT20 și SKLU1, indică faptul că creșterea celulelor in vitro este încetinită (sau abrogată în întregime) dacă volumul de mediu de cultură per celulă este mărit – fie prin utilizarea unor volume mari de analiză, fie prin reducerea numărului de celule însămânțate. Trebuie subliniat faptul că valorile b nu sunt nicidecum specifice pentru o anumită linie celulară, ci mai degrabă o consecință a mediului de cultură celular ales, a mai multor parametri de incubare a testelor și a procedurii experimentale, incluzând practic orice aspect care ar putea afecta creșterea clonală a celulelor care se află într-o situație de stres extrem atunci când sunt plasate ca celule individuale, cum ar fi formularea mediului, suplimentarea cu nutrienți și factori de creștere, metodele utilizate pentru separarea celulelor, materialele plastice etc.. De exemplu, utilizarea mediilor condiționate de la celulele BT20 aproape în stare de fluență a atenuat puternic comportamentul cooperant al celulelor BT20, în timp ce această procedură nu a avut niciun impact asupra creșterii clonogene a celulelor MDA-MB231 care nu cresc în mod cooperant. Mai mult, timpul de dublare a celulelor BT20 cooperative a depins atât de timpul de incubare a testului, cât și de densitatea celulară din gode, oferind astfel o explicație biologică evidentă pentru fracțiile de supraviețuire clonogenică imprecise obținute prin calcule bazate pe PE: Rata de creștere a unui grup de celule proliferante poate fi pur și simplu prea lentă pentru a atinge pragul de 50 de celule pe colonie în timpul de incubare al testului. Prin urmare, aparenta „neclonalitate” a unui grup de, de exemplu, 35 de celule cu proliferare lentă la momentul de oprire este doar o consecință inevitabilă a timpului de incubare a testului, care este – cel puțin într-o anumită măsură – ales în mod arbitrar. În acest context, am analizat, în plus, impactul timpului de incubare asupra fracțiilor de supraviețuire clonogenică obținute și am observat că este insuficientă determinarea punctului de oprire doar prin inspectarea vaselor de control, așa cum au sugerat alții: Încheierea prematură a perioadei de incubare poate duce la fracții de supraviețuire extrem de scăzute pe plăci cu tratament mai agresiv, unde repararea daunelor înainte de continuarea creșterii celulelor necesită timp suplimentar.
Important este faptul că datele noastre sunt pe deplin în concordanță cu descoperirile seminale ale cercetătorilor pionieri în domeniul culturilor celulare din anii 1940 și 1950 și reflectă pur și simplu un fenomen care făcea obiectul unor investigații extinse la acea vreme. Puck și colegii săi au fost primii care au publicat o curbă de supraviețuire a celulelor unice iradiate în 1956. Cu toate acestea, cea mai mare provocare științifică pentru această realizare fundamentală a fost o problemă nerezolvată la acea vreme a culturii de celule de mamifere: Liniile celulare încetau să mai crească in vitro imediat ce celulele erau plasate la o densitate scăzută. O încercare de a depăși această problemă a fost făcută în 1948 de Sanford și colab. care au reușit să cultive colonii de fibroblaste derivate din celule unice în mici capilare în care difuzia factorilor derivați din celule în mediu a fost puternic redusă, permițând astfel o stimulare suficientă a creșterii autocrine . Aceștia au identificat importanța precondiționării mediului de cultură de către celulele cultivate și au concluzionat că un mediu de cultură celulară suficient pentru a permite creșterea infinită a unei culturi de celule de mare densitate este, de fapt, „departe de a fi optim pentru creșterea unei singure celule”. În concordanță cu aceasta, Earle et al. au descris faptul că însămânțarea tipului de celule respective la o densitate foarte mică a dus la moartea celulelor , iar această lucrare a stat la baza primei publicații privind creșterea clonogenică a celulelor de mamifere in vitro de către Puck și Marcus în 1955 . Inspirați de necesitatea unui mediu de cultură condiționat pentru a facilita creșterea monocelulară, aceștia au utilizat un sistem de co-cultură de celule unice HeLa și un strat de celule de hrănire puternic iradiate de același tip. În concordanță cu studiile precedente, ei au concluzionat că inhibarea creșterii monocelulare în volume mari de testare se datorează „pierderii unui factor difuzibil cu durată de viață scurtă”. În publicațiile ulterioare, cum ar fi cea cu prima curbă de supraviețuire a celulelor de mamifere iradiate, Puck și colegii săi au omis frecvent utilizarea straturilor de hrănire, deoarece dezvoltaseră tehnici avansate de cultură care permiteau creșterea monocelulară cu 100% PE fără suplimentarea factorului de creștere cu celule de hrănire . Aceștia au afirmat că protocoalele de spălare și tripsinizare atentă erau esențiale în această privință și au inventat termenul „acțiune de cooperare” pentru a descrie faptul că celulele dintr-o farfurie de cultură pot diferi atât în ceea ce privește genotipul, cât și starea fiziologică . Rezultatele noastre recapitulează aceste observații: În cadrul unui panou de 50 de linii de celule canceroase, am observat că o creștere suboptimală a celulelor individuale în medii de cultură moderne, standardizate, suplimentate cu FCS, este încă un fenomen foarte comun, așa cum se poate deduce din constatarea că mai mult de jumătate dintre liniile celulare au prezentat un comportament de creștere cooperativă. Prin urmare, în cazul în care se constată PE suboptimale pentru o anumită linie celulară, este probabil ca testul clonogenic să detecteze simultan atât influența tratamentului de interes, cât și impactul cooperării celulare. Nu a făcut parte din domeniul de aplicare al acestui studiu identificarea factorilor specifici de susținere a creșterii care ar putea afecta PE al liniilor celulare analizate. Cu toate acestea, formulăm ipoteza că condițiile de creștere suboptime pentru celulele unice ale unei anumite linii celulare pot rezulta din parametri foarte diferiți, cum ar fi concentrațiile scăzute de factori de creștere clasici și/sau hormoni (de exemplu, factorul de creștere epidermică sau estrogenul), dar și diverși metaboliți cu greutate moleculară mică și mare pentru care cel puțin o fracțiune de celule unice prezintă auxotrofie. În plus, suplimentarea cu nutrienți a celulelor unice într-un vas de cultură va fi probabil influențată de parametrii fizico-chimici ai mediului înconjurător și ai vasului de plastic, inclusiv de gradul de legare la proteine a factorilor auxotrofici respectivi sau de adsorbția acestora pe suprafața de plastic. Teoretic, această problemă ar putea fi abordată prin luarea unor măsuri care să restabilească PE maxim în condiții de densitate scăzută, astfel încât să se (re)stabilească o corelație liniară între S și C (b = 1). Recomandările lui Puck privind utilizarea de celule de hrănire, medii condiționate și/sau încorporarea de celule individuale în agar moale pot fi suficiente pentru a realiza acest lucru pentru liniile celulare selectate și ar trebui să crească în mod corespunzător robustețea calculelor bazate pe PE. Cu toate acestea, este evident că poate fi mai mult decât o provocare să se rafineze și să se standardizeze condițiile de testare astfel încât ratele de supraviețuire și de creștere a celulelor unice să fie optime pentru fiecare tip de celulă unică de interes . Am decis să acceptăm condiții de testare suboptime pentru creșterea celulelor unice și, în schimb, am dezvoltat o metodă computațională pentru analiza datelor de supraviețuire clonogenică care ține cont de acest fenomen bine descris. Evident, abordarea noastră care utilizează regresia și interpolarea puterii a fost dincolo de capacitățile tehnice din anii 1950, când datele de supraviețuire erau ajustate cu ochiul liber . Cu toate acestea, cumva, relevanța cooperării celulare a ieșit din atenție în deceniile următoare. Deși de-a lungul timpului au fost raportate câteva rapoarte privind neliniaritatea în testele de formare a coloniilor, performanța limitată a analizelor bazate pe PE nu a fost abordată .
În mod interesant, aceste studii au raportat o creștere mai puțin liniară a numărului de colonii odată cu creșterea numărului de celule însămânțate pentru anumite tipuri de celule în condiții specifice. În concordanță cu acest lucru, pentru câteva linii celulare din panoul nostru am obținut, de asemenea, valori b ușor sub 1,0. Trei scenarii diferite pot explica această observație, dintre care două se datorează artefactelor metodologice: În primul rând, valorile b ușor sub 1,0 pot rezulta din numărarea puțurilor cu un număr mare de colonii supraîncărcate în care coloniile mici sunt trecute cu vederea de către cercetător (a se vedea puțurile marcate cu „nd” în Fig. 1a). În al doilea rând, creșterea celulară a vaselor cu un număr mare de celule poate fi inhibată în stadii destul de timpurii din cauza unei scăderi rapide a concentrației de nutrienți, rezultând astfel colonii avortate. O a treia opțiune – și mai puțin intuitivă din punct de vedere biologic – este comportamentul competitiv al creșterii celulare, de exemplu din cauza secreției de factori inhibitori de creștere. Este important faptul că oricare dintre aceste fenomene este luat în considerare de abordarea prin regresie și interpolare, deoarece aceasta ia în considerare orice abatere de la liniaritate, așa cum este reflectată de valoarea b.
Mai mult, este remarcabil faptul că valorile b ale diferitelor linii celulare pentru condițiile netratate comparativ cu cele iradiate nu sunt identice. În majoritatea acestor cazuri, valorile b ale celulelor iradiate tind să fie mai mari decât valorile b respective ale controalelor netratate, ceea ce indică faptul că cooperarea celulară crește la iradiere. În consecință, intervalul de valori ale fracției de supraviețuire obținute pentru C = 5 până la 100 de colonii devine mai larg decât în cazul unor valori b aproape identice (a se vedea liniile celulare HCC1806 și A549). Acest lucru implică faptul că, din punct de vedere tehnic, nu este posibil să se extragă valori de supraviețuire mai precise prin intermediul procedurii de testare clonogenică – cu excepția cazului în care s-a selectat un număr fix de colonii (C) pentru analiză. În plus, liniile celulare cu valori b extrem de ridicate pentru celulele tratate pot prezenta un interes deosebit în ceea ce privește studiile de rezistență la terapie. De exemplu, factorul (factorii) de supraviețuire indus(i) de radiații secretat(i) de un anumit tip de celule ar putea fi identificat(i) datorită unei valori b corespunzător de ridicate.
În concluzie, datele noastre arată necesitatea de a analiza cu atenție datele din experimentele de formare a coloniilor și de a lua în considerare impactul subestimat al cooperării celulare asupra calculelor fracției de supraviețuire. Acest lucru poate crește foarte mult fiabilitatea testului clonogenic – și rezistența oricărei ipoteze bazate pe acesta.
.