Rezultate și discuții
Pentru a înțelege mai bine formarea și repararea situsurilor AP care rezultă din repararea prin excizia bazelor și depurinarea/depirimidinarea spontană in vivo, am măsurat numărul de situsuri AP endogene în ADN genomic extras din diferite țesuturi de șobolani adulți și ficat uman de calitate transplant cu ajutorul testului ASB (3). Numărul de situsuri AP endogene a variat foarte mult de la un țesut la altul (Fig. 1)⇓, dar nu și în interiorul țesuturilor. Cel mai mare număr de situsuri AP a fost detectat în creier, cu 30 de situsuri AP la 106 nucleotide, urmat de inimă și colon. În schimb, ficatul de șobolan, rinichii și plămânii au prezentat în mod constant cel mai mic număr de situsuri AP (8-9 situsuri AP la 106 nucleotide). Numărul de situsuri AP endogene în ficatul uman a fost comparabil cu cel din ficatul de șobolan. Aceste date indică faptul că situsurile AP persistă la 50.000-200.000 de leziuni per celulă de mamifere în condiții fiziologice normale. Numărul staționar de situsuri AP în ADN genomic ar trebui să reflecte echilibrul dintre formarea și repararea situsurilor AP. Interpretările posibile ale numărului mai mare de situsuri AP endogene din creier sunt următoarele: (a) o rată mai mare de depurinare și/sau de formare de aducturi ADN endogene, rezultând mai multe situsuri AP; (b) o activitate mai mare a ADN-glicozilazei, care induce mai multe situsuri AP; (c) o activitate mai scăzută a endonucleazei AP de tip II, care determină acumularea de situsuri AP; și (d) o eficiență mai mică a dRp-azei sau a β-eliminării, lăsând situsuri AP 5′-încheiate.
Situri AP endogene în țesuturile de șobolan și umane. ADN-ul a fost extras la 4°C din țesuturi intacte de șobolan și ficat uman normal, iar numărul de situsuri AP a fost măsurat cu ajutorul testului ASB. A, film tipic cu raze X care arată situsurile AP endogene din țesuturile de șobolan. ADN-ul (inclusiv probele standard de ADN) a fost încărcat pe o membrană NC (1,5 μg pe fantă). B, date densitometrice de scanare a situsurilor AP endogene din țesuturile de șobolan și umane. Coloanele, medii din sloturi duplicate de cinci până la opt probe individuale; barele, DS.
Procesul principal în repararea situsurilor AP este calea dependentă de endonucleaza AP de tip II/β-pol (7). Endonucleaza AP de tip II poate recunoaște situsurile AP și poate inciza coloana vertebrală fosfodiesterică imediat 5′ față de leziuni, lăsând o grupare 3′-hidroxil și o terminație 5′-AP a situsului (5). 5′-dRp este eliberat ulterior, iar golul de un singur nucleotid este umplut. S-a demonstrat că în nucleul celulelor de mamifere sunt prezente cantități semnificative de endonucleasă AP de tip II (8). Anterior, am arătat că combinația dintre testul ASB și endonucleaza AP de tip II sau NaOH induce scindarea 3′ sau, respectiv, 5′ a situsurilor AP (3). Pentru a înțelege activitatea endonucleazei AP și a dRp-azei in vivo, am optimizat în continuare testul de scindare a situsului AP. În acest experiment, am folosit Exo III ca endonucleaza AP de tip II pentru a identifica clivarea 3′ a situsurilor AP și putrezina pentru a detecta 5′-nicks (Fig. 2)⇓. Pentru a caracteriza acest test de scindare a situsurilor AP, am incubat ADN-ul care a fost pretratat cu MX pentru a reduce numărul de situsuri AP la 3,8 ± 0,5 situsuri AP la 106 nucleotide (medie ± SD) cu tampon termic și acid. Diferite perioade de incubare cu căldură/acid au indus 11, 47, 115 și 320 de situsuri AP la 106 nucleotide. Un singur tratament cu Exo III a redus numărul de situsuri AP cu 4-10 situsuri AP la 106 nucleotide în fiecare probă de ADN, indiferent de numărul inițial prezent (Fig. 3)⇓. Această reducere se poate datora combinației dintre incizia enzimatică pe partea 5′ de către Exo III și clivarea nespecifică 3′ a situsurilor AP în timpul incubării cu Exo III. Această scindare nespecifică în 3′ a împiedicat cuantificarea precisă a numărului de situsuri AP în 3′ din ADN cu ajutorul acestui test. În schimb, tratamentul cu putrezină nu a arătat nicio reducere a numărului de situsuri AP. După incubarea cu Exo III urmată de putrezină, numărul de situsuri AP a fost redus la numărul inițial de situsuri AP în ADN de timus de vițel pretratat cu MX. Eficiența de scindare a situsurilor AP de către combinația Exo III și putrezină a fost de >99%.
Schema testului de scindare a situsului AP. Pentru a înțelege mai bine activitățile endonucleazei AP de tip II, precum și ale dRp-azei in vivo, am determinat existența clivajelor pe partea 5′ sau 3′ a situsurilor AP în ADN genomic. Putrezina și Exo III (endonucleaza AP de tip II) lasă situsuri AP clivate 3′ și, respectiv, clivate 5′. Pentru situsurile AP intacte, fără incizie pe părțile 3′ și 5′ ale situsurilor AP, testul ASB poate teoretic să detecteze numărul inițial de situsuri AP după tratamentul cu Exo III sau cu putrezină, deoarece situsurile AP rămân pe coloana vertebrală a ADN-ului după incizia de o parte și de alta a legăturii fosfodiesterice adiacente situsului AP. Cu toate acestea, combinația dintre Exo III și putrescenă scindează atât pe partea 3′, cât și pe partea 5′ a situsului AP , ceea ce duce la eliberarea situsului AP din coloana vertebrală a ADN. Astfel de situsuri AP eliberate nu sunt detectate de acest test. Pe baza numărului de situsuri AP rămase pe coloana vertebrală a ADN după această reacție de scindare, se poate estima numărul de situsuri AP scindate în 5′ și 3′. În cazul în care în ADN sunt prezente situsuri AP clivate în 5′, tratamentul unic cu putrezină poate elibera situsurile AP clivate în 5′ prin excizia în 3′ a situsurilor AP . În mod similar, situsurile AP 3′-încheiate din ADN pot fi eliberate prin excizia 5′ cu ajutorul Exo III .
Testul de scindare a situsului AP din ADN de timus de vițel tratat cu tampon termic/acid. Pentru a valida testul de scindare a situsului AP, am examinat efectele Exo III și ale putrezinei asupra situsurilor AP intacte induse în ADN de timus de vițel. Numărul inițial de situsuri AP din ADN de timus de vițel a fost redus cu MX (CTD/MX). ADN-ul a fost apoi incubat în tampon termic/acid pentru diferite perioade de timp pentru a introduce diferite numere de situsuri AP intacte (-/-; Ref. 9). ADN-ul a fost incubat cu Exo III și/sau putrezină, iar numărul de situsuri AP rămase în ADN de timus de vițel a fost măsurat prin testul ASB . Coloane, medii din sloturi duplicate din trei probe individuale; bare, SD. A, testul de scindare a situsurilor AP din ADN care conține 115 situsuri AP la 106 nucleotide. B, rezumat al testului de scindare a situsurilor AP din ADN care conține diferite numere de situsuri AP.
Am aplicat acest test la ADN genomic extras din țesuturi de șobolan și umane pentru a caracteriza situsurile AP endogene. Fracțiile de situsuri AP intacte și scindate, precum și leziunile aldehidice reziduale sunt rezumate în Fig. 4⇓. ADN-ul de țesut de șobolan și uman a fost incubat cu Exo III urmat de putrezină pentru a examina dacă leziunile detectate erau situsuri AP reale. După scindarea 5′ și 3′ a situsurilor AP, au fost detectate 1,5-2,2 leziuni aldehidice reziduale la 106 nucleotide. Aceste date indică faptul că testul ASB măsoară corect situsurile AP endogene. Leziunile reziduale se pot datora limitărilor reacțiilor enzimatice în testul de scindare a situsului AP, precum și prezenței leziunilor aldehidice endogene ale bazelor, cum ar fi formiluracilul (10). În plus, a fost detectată o fracțiune combinată de situsuri AP 3′ clivate și intacte de ∼2-3 leziuni la 106 nucleotide în diferite țesuturi, ceea ce reprezintă ∼1/3-1/10 din numărul total de situsuri AP endogene. Pentru a examina numărul de situsuri AP clivați 5′, am incubat ADN-ul cu putrezină. Reducerea situsurilor AP de către putrezină (numărul original de situsuri AP minus numărul de situsuri AP rămase după incubarea cu putrezină) a reprezentat numărul de situsuri AP clivate 5′. Spre deosebire de ADN de timus de vițel pretratat cu tampon termic/acid, ADN-ul genomic tratat cu putrezină a avut un număr semnificativ redus de situsuri AP. Aceste date indică faptul că aproximativ două treimi sau mai mult din situsurile AP endogene sunt deja scindate pe partea 5′ a situsurilor AP in vivo.
Rezumat al testului de scindare a situsului AP din ADN de țesut de șobolan și uman. Numărul inițial de situsuri AP, așa cum este descris în legenda la Fig. 1B⇓, a constat în situsuri AP clivate 5′, situsuri AP clivate 3′, situsuri AP intacte și leziuni aldehidice reziduale. Numărul de situsuri AP 5′-cleaved a fost calculat ca fiind numărul original de situsuri AP minus numărul de situsuri AP rămase după tratamentul cu putrezină singură. Fracția combinată de situsuri AP 3′-cleaved și intacte a reprezentat diferența dintre tratamentul cu putrezină și tratamentul combinat cu Exo III și putrezină. Siturile AP reziduale au arătat numărul de leziuni aldehidice necuprinse.
După clivarea 5′ a situsurilor AP de către endonucleaza AP de tip II, situsurile AP incizate trebuie ulterior să fie eliberate din coloana vertebrală a ADN prin excizia reziduurilor 5′-dRp. Acest proces de eliberare este posibil să fie realizat de către dRp-ază prin reacție hidrolitică (11) sau β-eliminare (12) sau prin intermediul unei enzime endonucleolitice care incizează în aval de fracțiunile 5′-dRp (13). S-a demonstrat că Xenopus și β-pol uman eliberează 5′-dRp prin β-eliminare (14). Utilizând dimensiunea patch-urilor de reparare fie în celule β-pol-nule, fie în celule -proficiente, s-a demonstrat că o singură cale de reparare a lacunelor era predominantă în celulele β-pol-proficiente, dar nu și în celulele β-pol-nule (15). În plus, interacțiunea dintre endonucleaza AP umană și β-pol accelerează eliberarea de reziduuri 5′-dRp in vitro (16). Cu toate acestea, eficiența de reparare a fracțiunilor 5′-dRp nu a fost bine caracterizată în celule sau in vivo. Utilizând extracte libere de celule de drojdie, s-a constatat că procesarea fracțiunilor 5′-dRp este o etapă de limitare a vitezei în timpul reparării prin excizie de bază a ADN-ului care conține uracil (17). În plus, a fost examinată eficiența catalitică a β-pol pentru eliminarea 5′-dRp (18). În mod interesant, Kcat-ul activității de 5′- dRp-ază a β-pol a fost de ∼100 de ori mai mic decât Kcat-ul endonucleazei AP. Acest studiu demonstrează o persistență clară a situsurilor AP 5′-incisate în țesuturile umane și de șobolan. Aceste date sugerează că incizia de către AP endonucleasa și eliberarea ulterioară a reziduurilor 5′-dRp ar putea să nu fie legate în mod eficient la un nivel bazal in vivo și că procesul de reparare a 5′-dRp ar putea fi una dintre etapele care limitează viteza în repararea prin excizie de baze.
În studiul anterior (3), am demonstrat că depurinarea spontană a avut loc la 1,5 situsuri AP la 106 nucleotide pe zi în condiții fiziologice. Pentru a testa dacă produșii ADN-labili la căldură, cum ar fi purinele N3- și N7-alchil purine, au fost sursa numărului mai mare de situsuri AP endogene din creier, s-a efectuat un test de depurinare în ADN-ul din creier și ficat. Cu toate acestea, nu s-a observat nicio diferență în creier și ficat (datele nu sunt prezentate). Prin urmare, este posibil ca starea de echilibru a situsurilor AP endogene să nu se datoreze leziunilor bazice labile. Una dintre cele mai importante și mai abundente leziuni endogene ale ADN-ului este deteriorarea oxidativă a bazelor ADN. S-a raportat că starea de echilibru a 5-hidroxicitosinei în creierul de șobolan este de ∼2 ori mai mare decât cea din ficatul de șobolan (19). Astfel de baze pirimidinice oxidative sunt reparate de End III, lăsând situsuri AP pe coloana vertebrală a ADN. Pentru a examina dacă stresul oxidativ ar putea fi legat de numărul staționar de situsuri AP din ADN, situsurile sensibile la End III au fost cuantificate folosind combinația dintre testul ASB și E. coli End III. Numărul de situsuri sensibile la End III a fost de trei ori mai mare în creier (14 leziuni la 106 nucleotide) în comparație cu alte țesuturi (4-5 leziuni la 106 nucleotide). Recent, omologul uman al genei End III (hNTH1) a fost clonat și caracterizat (20). Expresia ARNm a acestei gene variază de la un organ la altul după un model care corespunde cu numărul de situsuri AP endogene (20). Majoritatea glicozilazelor ADN implicate în repararea bazelor oxidate posedă o activitate de liază AP, care clivează partea 3′ a situsurilor AP. Prin urmare, situsurile AP 5′ endogene nu ar proveni din scindarea bazelor oxidate de către astfel de ADN-glicozilaze. Un experiment preliminar a arătat că peroxidul de hidrogen cu FeSO4 a indus direct situsuri AP clivate 5′ în ADN de timus de vițel fără nicio enzimă (datele nu sunt prezentate). Aceste studii sugerează că stresul oxidativ ar putea fi unul dintre factorii responsabili pentru starea de echilibru a situsurilor AP cu clivaj 5′.
Ne așteptam inițial să găsim un număr redus de situsuri AP endogene în ADN genomic din cauza toxicității și mutagenității lor. Cu toate acestea, acest studiu arată că starea de echilibru a situsurilor AP este de ∼1 leziune la 105 nucleotide în ADN genomic. Deși situsurile AP sunt reparate în mod constant, fracțiunea de situsuri AP care scapă reparării este probabil să contribuie la mutații, aberații cromozomiale și erori de transcripție care pot fi asociate cu boli spontane legate de vârstă, cum ar fi cancerul și tulburările degenerative.
.