Sinteza și activitatea de modulare a rezistenței antimicrobiene a derivaților de 2,4-Dinitrofenilhidrazonă ca agenți împotriva unor agenți patogeni umani ESKAPE

Abstract

O bibliotecă de șase fenilhidrazone noi a fost sintetizată și evaluată pentru activitatea lor antimicrobiană și de modulare a rezistenței in vitro împotriva unui panel de specii Gram-pozitive, Gram-negative și fungice. Compușii au fost produși cu randamente bune de 60-92% p/p și au fost caracterizați folosind tehnici de punct de topire, spectroscopie UV-visible, infraroșu și rezonanță magnetică nucleară (1H, 13C și DEPT-Q). Spectroscopia de masă a fost utilizată pentru a confirma identitatea unuia dintre cei mai activi compuși, 5 . Fenilhidrazonele au demonstrat activitate împotriva tuturor celor șase microorganisme selectate, cu valori ale concentrației minime inhibitorii (CMI) ale celor mai activi compuși, 1 și 5 , de 138 µM (Klebsiella pneumoniae) și, respectiv, 165 µM (Streptococcus pneumoniae). Compusul 1 a demonstrat, de asemenea, o activitate de modulare a rezistenței ridicată la 1,078 µM împotriva Streptococcus pneumoniae și Klebsiella pneumoniae.

1. Introducere

În ultimele decenii, lumea este în criză de antibiotice eficiente din cauza prevalenței crescute a organismelor multirezistente la medicamente . Acest lucru a dus la o creștere a infecțiilor rezistente, ceea ce obligă oamenii de știință să exploreze fără încetare posibilitatea de a sintetiza analogi ai compușilor activi sau principali ca noi antimicrobiene pentru a frâna aceste infecții și bolile care rezultă. De-a lungul secolelor, bolile infecțioase au devenit o amenințare majoră la adresa existenței omenirii, deoarece continuă să aibă un impact negativ semnificativ asupra societății. Agenții patogeni, cum ar fi bacteriile, virușii, ciupercile și paraziții, continuă să apară și sunt în creștere, în special în secolul XXI, în ciuda mai multor încercări de a le reduce . Bolile infecțioase sunt responsabile de moartea a aproximativ 17 milioane de persoane anual, cu apariția a cel puțin treizeci de boli noi. În prezent, lumea se luptă cu pandemia COVID-19 cauzată de virusul corona, care a făcut deja peste 25 000 de victime la nivel mondial în decurs de trei luni (OMS, 2020). Aceste boli amenință sănătatea a milioane de oameni, mai ales că nu există niciun leac sau vaccin. Tendința de creștere a infecțiilor microbiene se datorează în mare parte problemei perene a rezistenței antimicrobiene, care a fost în ascensiune. Printre principalele cauze multiple ale rezistenței antimicrobiene se numără chimioterapia prelungită și nerespectarea regimului de dozare .

Rezistența tot mai mare la antibiotice a dus la tendința de creștere a agenților patogeni, cum ar fi Staphylococcus aureus rezistent la meticilină (MRSA), Mycobacterium tuberculosis rezistent la mai multe medicamente (MDR-TB) și Escherichia coli rezistent la mai multe medicamente (MDR-Escherichia coli) . În plus, cei mai importanți în tratamentul infecțiilor nosocomiale sunt agenții patogeni ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa și speciile Enterobacter) . Prezența lor în infecții a reprezentat o situație îngrijorătoare în sectorul sănătății, deoarece majoritatea acestora sunt rezistente la multe antibiotice, iar înțelegerea mecanismului de rezistență a acestor tulpini este utilă în dezvoltarea de noi agenți antimicrobieni .

Organizația Mondială a Sănătății a precizat că tendința de creștere a bolilor infecțioase va continua din cauza unui număr de factori, inclusiv migrația rurală-urbană, creșterea populației globale, adaptarea microbiană și schimbările climatice . Aceștia ar favoriza apariția și răspândirea agenților patogeni, astfel încât părțile interesate, inclusiv chimiștii medicinali, sunt îndemnate în permanență să elaboreze strategii pentru a descoperi noi agenți chimioterapeutici pentru a depăși amenințarea rezistenței antimicrobiene . Activitatea de modulare a rezistenței unui compus este capacitatea compusului de a avea o influență de control asupra standardelor deja cunoscute, în special într-un mod pozitiv. Din cauza rezistenței tot mai mari a microorganismelor la antibiotice, agenții din surse naturale sau sintetice par să moduleze activitatea unor agenți antimicrobieni standard, cum ar fi amoxicilina (a), ciprofloxacina (b) și fluconazolul (c) (figura 1) (Figura 1).

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Figura 1

Structurile chimice ale unor antibiotice standard : (a) amoxicilină; (b) ciprofloxacină; (c) fluconazol.

Activitățile de modulare a rezistenței produselor (atât naturale cât și de sinteză) asupra antibioticelor standard au câștigat interes științific în ultimii ani. Acest lucru are ca scop maximizarea potenței antimicrobiene cu pași importanți în reducerea rezistenței microbiene și, prin urmare, duce la descoperirea unor potențiale medicamente. O clasă importantă de astfel de agenți sintetici cu un efect promițător de modulare a rezistenței este reprezentată de hidrazone . Hidrazonele și analogii lor posedă funcționalitatea azometină, un grup important de compuși cu un spectru larg de activități biologice . Hidrazonele au fost alese datorită gamei lor largi de activități farmacologice, cum ar fi activitățile anticonvulsivante, antiinflamatorii, antimicrobiene, antiprotozoare și anticancerigene. Aceștia joacă un rol crucial nu numai în biologie, ci și în domeniul fotochimiei, al chimiei analitice și al chimiei anorganice. Hidrazonele sunt înrudite cu cetonele și aldehidele prin înlocuirea oxigenului cu o fracțiune funcțională -NNH2 . Datorită diverselor protocoale de sinteză și a studiilor detaliate privind relația structură-activitate (SAR), au fost dezvoltați și descoperiți diferiți derivați de hidrazonă care sunt farmacologic activi la diferite ținte . S-a constatat că unii derivați de hidrazonă ai izonicotinoilului posedă activitate antituberculoasă. Mai mult, s-a constatat că derivatul hidrazonei acidului benzoic, acidul 4-hidroxibenzoic -hidrazidă (nifuroxazidă), a fost activ împotriva viermilor intestinali, iar derivatul acidului 4-fluorobenzoic -hidrazidă a prezentat activitate antibacteriană împotriva Staphylococcus aureus ATCC 29213 la 3,13 μg/mL și a tulpinii sensibile Mycobacterium tuberculosis H37RV, de asemenea, la 3,13 μg/mL . Hidrazonele sintetizate recent, inclusiv nifuroxazida, s-au dovedit a fi active împotriva tulpinii H37RV de Mycobacterium tuberculosis la o concentrație minimă inhibitorie de 0,78-6,25 μg/ml. Un nou agent, 3, 5-dibenzoilvanililină hidrazonă, și complecșii metalelor de tranziție s-au dovedit a prezenta o activitate antibacteriană impresionantă.

În consecință, în acest studiu, șase noi derivați de fenilhidrazonă au fost sintetizați cu succes prin reacția de condensare nucleofilă, fiind investigate activitățile lor antimicrobiene și efectele de modulare a rezistenței.

2. Materiale și metode

2.1. Sinteză: Materiale și metode generale

Un balon cu fund rotund (100 mL) echipat cu o bară de agitare magnetică a fost încărcat cu 2,4-dinitrofenilhidrazină (1 eq.) în metanol (10 mL) menținut într-o baie de gheață. Suspensia rezultată a fost agitată și răcită la 0°C înainte de a se adăuga, picătură cu picătură, H2SO4 concentrat (98% v/v, 2 mL), ceea ce a dat o soluție galben pal. După ce s-a răcit la temperatura camerei, s-a adăugat un derivat de aldehidă sau cetonă (1,04 eq.) în metanol (5 mL) și amestecul a fost agitat până la formarea treptată a unui precipitat care a fost lăsat timp de 24 de ore. Progresul reacțiilor chimice a fost monitorizat prin cromatografie în strat subțire (TLC) în mod intermitent, folosind plăci de aluminiu acoperite cu silicagel (60 GF254). Plăcile au fost vizualizate sub lumină UV la 254 nm și 366 nm, care a fost urmată de pulverizarea cu anizaldehidă pentru confirmarea identității spoturilor. Produsul brut a fost filtrat prin filtrare prin aspirație și recristalizat din etanol absolut fierbinte (96% v/v). Produsul solid a fost obținut prin filtrare prin aspirație, uscat și depozitat la temperatura camerei.

Structurile compușilor sintetizați au fost stabilite prin determinări ale punctului de topire, spectroscopie de masă, spectroscopie RMN 1D (proton și carbon-13) și RMN 2D (DEPT-Q) cu sprijinul tehnicilor de spectroscopie în infraroșu (IR) și ultraviolet- vizibil (UV-Vis) .

2.1.1. 1-(2,4-Dinitrofenil)-2-(difenilmetilen) Hidrazina

2, 4-Dinitrofenilhidrazina (0,50 g, 2,74 mmol, 1 eq.) în prezența benzofenonei (0,53 g, 1,04 eq., 2,64 mmol) a dat produsul brut care a fost purificat prin recristalizare din etanol fierbinte pentru a obține produsul (0,84 g, 85%) ca un solid portocaliu deschis. (Eter Pet. 70%: EtOAc 30%): 0,90. Mpt: 141-143°C; UV-V este (MeOH) : 382 nm. Infraroșu (neat) υmax cm-1: 3382 (OH), 3286 (NH), 1586 (C = CH), 848, 614 (ArH). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09-9,10 (1H, H-C3, s, ArH), 8,41 (1H, H-C5, d, J = 2,4, ArH), 8,37-8,38 (1H, H-C6, m, ArH), 7,37-8,38 (1H, H-C6, m, ArH).66-7.72 (5H, H-C4′, H-C5′, H-C6′, H-C5′, H-C3′, m, ArH), 7.35 (3H, H-C6″, H-C5″, H-C4″, m, ArH), 7.57 (2H, H-C5′, H-C3′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz; CDCl3) 155,7, 145,1, 136,5, 131,9, 130,5, 130,4, 130,1, 129,9, 128,6, 128,2, 127,9, 123,4, 116,6 ppm.

2.1.2. 1-Benziliden-2-(2,4-dinitrofenil) Hidrazina

2, 4-Dinitrofenilhidrazina (0,90 g, 4,53 mmol, 1 eq.) în prezența benzaldehidei (0,50 g, 1,04 eq., 4,71 mmol) a dat produsul brut care a fost purificat prin recristalizare din etanol fierbinte pentru a obține produsul (1,01 g, 78%) sub formă de solid galben. (Eter pet. 70%: EtOAc 30%): 0,83. Mpt: 178-180°C; UV-V este (MeOH): 224 nm și 378 nm. Infraroșu (neat) υmax cm-1: 3337 (OH), 3283 (NH), 3100 (C = CH), 1618, 1584 (ArC = C). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09 (1H, H-C3, s, ArH), 8,30-8,31 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8,05 (1H, H-C5, m, ArH), 8,05 (1H, H-C5, m, ArH).02 (1H, H-C6, m, ArH), 7.41-7.69 (2H, H-C2′, H-C6′, m, ArH), 7.40 (1H, H-C4′, m, ArH), 7.39 (2H, H-C3′, H-C5′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 147,9, 145,8, 144,9, 144,7, 131,0, 130,0, 129,0, 127,6, 123,5, 116,8 ppm.

2.1.3. 3-(2-2-(2-2-(4-Dinitrofenil) Hidrazono) Metilfenol

2, 4-Dinitrofenilhidrazină (0,78 g, 3,93 mmol, 1 ecuație) în prezența m-hidroxibenzaldehidei (0,50 g, 1,04 ecuație, 4,09 mmol) a dat produsul brut care a fost purificat prin recristalizare din etanol fierbinte pentru a obține produsul (0,76 g, 64%) sub formă de solid roșu închis. (Eter Pet. 70%: EtOAc 30%): 0,74. Mpt: 277-280°C. UV-Vis (MeOH): 392 nm. Infraroșu (neat) υmax cm-1: 3420 (OH), 3257 (NH), 3116 (C = CH), 1607, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.56 (1H, H-C1, s, NH), 10.04 (1H, H-C2′, s, ArOH), 8.88 (1H, H-C3, s, ArH), 8.86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8.35-8.37 (1H H-C5, d, J = 8.0, ArH), 8.08-8.34 (1H, H-C6), d, J = 12.0, ArH), 8.05 (1H, H-C5′, m, ArH), 7.66 (1H, H-C1′, s, ArH), 7.14 (1H, H-C4′, m, ArH), 6.87-6.89 (1H (H-C3′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 160,5, 150,5, 144,9, 137,1, 130,2, 129,8, 129,5, 125,2, 123,6, 117,1, 116,4 ppm.

2.1.4. 4-(2-(2-(2,4-Dinitrofenil) Hidrazono) Metil)-2-metoxifenol

2, 4-Dinitrofenilhidrazină (0,78 g, 3,93 mmol, 1 ecuație) în prezența 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidei (vanilină) (0,50 g, 1,04 ecuație, 4,09 mmol) a dat produsul brut care a fost purificat prin recristalizare din etanol fierbinte pentru a obține produsul (0,91 g, 70%) sub formă de solid de culoare roșu aprins. (Eter pet. 70%: EtOAc 30%): 0,66. Mpt: 270-273°C. UV-Vis (MeOH): 218 nm și 394 nm. Infraroșu (neat) υmax cm-1: 3363 (OH), 3274 (NH), 3111 (C = CH), 1605 (ArC = C), 699 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.58 (1H, s, NH), 10.11 (1H, H-C4′, s, ArOH), 9.94 (1H, H-C3, s, ArH), 8.87 (1H, H-C5, s, ArH), 8.86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8.35 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7.97 (1H, H-C2′, d, J = 4.0, ArH), 7.66-7.76 (1H, H-C6′, d, J = 8.0, ArH), 6.38-6.35 (1H, H-C5′, d, J = 12.0, ArH), (3H, H-C4′, Ar-OCH3). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 150,7, 150,2, 148,6, 144,9, 137,1, 130,2, 125,6, 123,6, 123,1, 117,2, 116,1, 110,3, 56,2 ppm.

2.1.5. (Z)-2-(2, 4-Dinitrofenil) Hidrazono) Metilfenol

2, 4-Dinitrofenilhidrazina (0,78 g, 3,93 mmol, 1 eq.) în prezența salicilaldehidei (0,50 g, 4,09 mmol, 1,04 eq.) a dat produsul brut care a fost purificat prin recristalizare din etanol fierbinte pentru a obține produsul (1,09 g, 92%) ca un solid portocaliu strălucitor. (eter de Pet. 70%: EtOAc 30%): 0,84. Mpt: 176-180°C; UV-Vis (MeOH): 386 nm. Infraroșu (neat) υmax (cm-1): 3334 (OH), 3267 (NH), 3059 (C = CH), 1583 (ArC = C), 759 (ArH) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.25 (1H, H-C3′, s, ArOH), 9.98 (1H (C1), s, NH), 9.11 (1H H-C3, s, ArH), 8.34-8.34-8.36 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8.33 (1H, H-C5, d, J = 4.0, ArH), 7.61-7.58 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7.61-7.58 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7.31 (1H, H-C6′, m, ArH), 7,25 (1H, H-C4′, m, ArH), 7,24 (1H, H-C7, m, ArH), 6,95 (1H, H-C5′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 157,9, 151,3, 132,9, 131,4, 130,6, 123,7, 120,3, 117,2, 116,9, 115,3 ppm. HRMS (ESI): m/z calculat pentru + C13H10N4O5: 302.2400, găsit: 301.0000.

2.1.6. 4-(2-(2-(2, 4-Dinitrofenilhidrazono) metil) benzen-1, 3-diol

2, 4-Dinitrofenilhidrazină (0,69 g, 3,48 mmol, 1 ecuație) în prezența 2, 4-dihidroxi benzaldehidei (0,50 g, 1,04 ecuație, 3,62 mmol) a dat produsul brut care a fost purificat prin recristalizare din etanol fierbinte pentru a obține produsul (0,66 g, 2,07 mmol, 60%) sub formă de solid roșu închis. (Eter pet. 70%: EtOAc 30%): 0,51. Mpt: 270-274°C; UV-Vis (MeOH): 403 nm. Infraroșu (neat) υmax (cm-1): 3364 (OH), 3094 (C = CH), 1612, 1584 (ArC = C) 592 (ArH). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 11,58 (1H, H-C3′, s, ArOH), 10,11 (1H, H-C1, s, NH), 9,94 (1H, H-C5′, s, ArOH), 8,87 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, s, N = CH), 8,86 (1H, s, N = CH).33 (1H, H-C4′, s, ArH), 8,36 (1H, H-C5, d, J = 12,0, ArH), 7,95-7,97 (1H, H-C6, d, J = 8,0, ArH), 7,54 (1H, H-C7, m, ArH), 6,38 (1H, H-C6′, d, J = 8,0, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) 161,8, 159,1, 148,2, 144,6, 136,7, 130,1, 129,3, 128,8, 123,6, 116,9, 112,0, 108,7, 102,1 ppm.

2.2. Evaluarea antimicrobiană a compușilor

2.2.2.1. Sursa organismelor de testare

Culturi pure de Staphylococcus aureus (SA) (ATCC 25923), Escherichia coli (EC) (ATCC 25922) și Pseudomonas aeruginosa (PA) (ATCC 27853) au fost obținute de la Divizia de Microbiologie a Departamentului de Farmacie, Facultatea de Farmacie și Științe Farmaceutice, Universitatea Kwame Nkrumah de Știință și Tehnologie (KNUST), Kumasi. Cu toate acestea, Klebsiella pneumoniae (KP), Candida albicans (CA) și Streptococcus pneumoniae (SP) au fost tulpini clinice obținute de la Komfo Anokye Teaching Hospital, Kumasi, și cultivate în cadrul Departamentului de Farmacie, KNUST.

2.2.2.2. Determinarea concentrației minime inhibitorii (CMI)

Metoda diluției în microbromă a fost utilizată pentru determinarea concentrațiilor minime inhibitorii (CMI) ale derivaților de hidrazonă și ale medicamentelor de referință ciprofloxacină și fluconazol. Plăcile de microtitrare cu 96 de godeuri au fost umplute cu 125 µL de bulion nutritiv de dublă concentrație și s-au adăugat diferite concentrații de derivați de hidrazonă. Medicamentele de referință în intervalul 12.5 µL/mL până la 40 µL/mL au fost tratate în mod similar. În fiecare fântână s-a adăugat o alicotă de 1 × 105 ufc/mL de organisme de testare. Plăcuța de control a fost umplută numai cu bulion nutritiv ș i organisme de testare. Plăcile de testare ș i de control au fost incubate la 37 °C (24 de ore pentru bacterii ș i 48 de ore pentru ciuperci), după care s-au introdus 20 µl de 1,25 mg/ml de bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu (MTT) în fiecare gode. După 20 de minute, s-a observat apariția unei colorații purpurii, ceea ce indică o creștere. Concentrațiile minime ale derivaților de hidrazonă și ale medicamentelor de referință care nu au prezentat modificări de culoare în godeuri au fost considerate ca fiind valorile CMI . Determinările au fost efectuate în repetiții.

2.2.3. Studii de modulare a rezistenței

Pentru studiile de modulare, plăcile cu 96 de godeuri au fost umplute cu 125 µL de bulion nutritiv de tărie dublă și s-a adăugat același volum de 40 µL de fenilhidrazone. S-au adăugat diferite concentrații în intervalul 50 µL/ml până la 7,812 µL/ml și 15,625 µL/ml până la 7,812 µL/ml de ciprofloxacină și, respectiv, fluconazol. În fiecare fântână s-au adăugat 25 µl conținând 1 × 105 ufc de organisme de testare, iar plăcile au fost incubate la 37°C (timp de 24 și, respectiv, 48 de ore pentru bacterii și ciuperci), după care s-au adăugat 20 µl de MTT în fiecare fântână. Apariția unei schimbări de culoare de la tulbure în godeuri la purpuriu a fost înregistrată și comparată doar cu CMI ale medicamentelor de referință . Determinările au fost efectuate în repetiții.

3. Rezultate și discuții

3.1. Analiza structurală a fenilhidrazonelor

Ruta sintetică utilizată pentru sinteza compușilor a fost urmată de reacția standard de condensare între aldehide sau cetone și hidrazine, luând în considerare disponibilitatea comercială a elementelor constitutive (Schema 1). O abordare de deconectare retrosintetică ne-a permis să identificăm diverse aldehide și o cetonă ca intermediari cheie pentru sinteza compușilor doriți. Procesul implică un atac nucleofilic aromatic determinant al ratei de 2, 4-dinitrofenilhidrazinei asupra carbonilului într-o soluție acidificată. Aceasta a fost urmată de deshidratarea intermediarului reactiv pentru a obține produsul final derivat de 2, 4-dinitrofenilhidrazonă.

Datele pentru procedurile de sinteză sunt incluse în secțiunea experimentală și sunt interpretate conform secvenței: intervalul punctului de topire (Mpt.) în grade Celsius (°C), lungimea de undă a absorbției maxime din spectrul ultraviolet-vizibil, spectrul infraroșu, 1H RMN , 13C RMN și HRMS ca instrument de confirmare pentru SA5 (compusul 5) (unul dintre cei mai activi compuși).

3.1.1.1. Spectroscopia UV-Vis

Spectrele pentru toți cei șase compuși au fost determinate atât în ultraviolet, cât și în lungimile de undă vizibile (200-800 nm) ca instrument de confirmare pentru BP1 în informațiile suplimentare, folosind metanol ca martor. Benzile de absorbție de la 203 nm și 403 nm, care au fost obținute în spectrele electronice ale fenilhidrazonelor sintetizate, pot fi atribuite tranzițiilor, la care contribuie diferiții auxocromi substituenți de pe fenilhidrazone. Se știe că fenilhidrazonele sunt absorbite la diferite lungimi de undă în domeniul UV- vizibil.

De exemplu, compusul BP1, atunci când este dizolvat în metanol și scanat în domeniul UV- vizibil, a prezentat absorbție la 203 nm, 314 nm și 382 nm, care ar putea fi atribuită conjugării extinse în fenilhidrazone după cuplarea benzofenonei și a 2,4-dinitrofenilhidrazinei. Cu toate acestea, compusul BP1 a prezentat o absorbție maximă la 382 nm, iar acest lucru ar putea fi atribuit unei creșteri a conjugării. De asemenea, compușii BA2, MHB3, VL4, SA5 și DHB6 au prezentat o absorbție maximă la 378 nm, 392 nm, 394 nm, 386 nm și, respectiv, 403 nm, după cum se observă în informațiile justificative.

Conjugarea extinsă poate fi atribuită prezenței cromoforilor în fenilhidrazonele care includ BP1 (doi cromofori de inel aromatic), MHB3 (meta hidroxi auxocrom), VL4 (un hidroxi și metoxi auxocrom), SA5 (orto hidroxi auxocrom) și DHB6 (doi hidroxi auxocromi). Acest lucru sugerează că hidrazonele cu auxocromi și cromofor suplimentar au avut o conjugare extinsă care a dus la o deplasare spre dreapta (deplasare batocromică).

3.1.2. Spectroscopia în infraroșu

Spectrul în infraroșu dă o idee despre grupele funcționale dintr-un compus. Din spectrul în infraroșu al compusului 5 ca eșantion, prezența benzii largi care se întinde de la aproximativ 3300 cm-1 și care se înclină în regiunea CH alifatice de aproximativ 3000 cm-1 indică prezența unei grupări funcționale hidroxi, în acest caz cea a unui fenol, așa cum se observă în informațiile justificative.

S-a observat, de asemenea, din spectrul IR (informații suplimentare) că compuși precum MHB3, VL4, SA5 și DHB6 au prezentat un vârf puternic și ascuțit al benzii lor de întindere C = C în regiunea 1138-1620 cm-1 în comparație cu BP1 și BA2, care nu au funcția hidroxi, așa cum se arată în tabelul 1. Prezența C = N, care se formează în urma reacției de condensare dintre hidrazină și carbonili, a fost suprapusă de carbonii aromatici hibridizați sp2 (C = C) din benzen care vibrează la 1138-1640 cm-1 în funcție de atașamentele substituenților. Deoarece frecvențele de vibrație C = N se încadrează în intervalul 1580-1600 cm-1, benzile lor nu pot fi distinse clar în prezența omologilor lor aromatici C = C, așa cum reiese din datele experimentale.

3.1.3. Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară (RMN)

Determinările RMN au fost efectuate pentru toate cele șase fenilhidrazone sintetizate folosind o tehnică RMN unidimensională (1D) (1H și 13C) și o tehnică RMN bidimensională, mărirea fără distorsiuni prin transfer de polarizare pentru carboni cuaternari (DEPT-Q). Aceste date sunt atribuite fiecărui compus în secțiunea experimentală. Structurile au fost confirmate cu datele spectrale 1H RMN, 13C RMN și DEPT-Q, așa cum se arată în informațiile suplimentare pentru compușii BP1, BA2, MHB3, VL4, SA5 și, respectiv, DHB6. Având în vedere DHB6 (compusul 6), (figura 2, tabelul 1) și din RMN de protoni (informații suplimentare), o deplasare chimică care prezintă o rezonanță mult în josul câmpului a însemnat prezența protonului hidroxi cu un semnal singlet. Acesta a rezonat mai mult în josul câmpului decât protonul aminei secundare din cauza efectului de desecretizare crescut al oxigenului electronegativ . Această deplasare chimică a fost ușor mai mare decât cea a grupului hidroxil ( 9,94 ppm) deoarece primul este mai aproape de mediul chimic al atomului de azot electronegativ din legătura imină. Prin urmare, primul semnal singlet al hidroxidului la 11,54 ppm a fost urmat de un semnal singlet al protonului amino secundar la 10,11 din cauza electronegativității grupului de azot înaintea celuilalt semnal al hidroxidului. Protonul aromatic intercalat între două grupări nitro electronegative a fost următorul semnal care a rezonat în câmp descendent la 8,86 ppm. Acesta a fost urmat de protonul din apropierea grupului amino terțiar. Grupul amino terțiar atașat la protonul iminei a cauzat desecretizarea și rezonanța în câmp descendent a protonilor iminei la 8,86 ppm cu un semnal singlet. Protonul singuratic cel mai apropiat de grupul nitro din poziția para a fost următorul semnal cu un vârf dublet la 7,95-7,97 ppm. Celălalt proton singuratic cel mai apropiat de grupul amino secundar mai puțin electronegativ a dat, de asemenea, un semnal dublet la 7,64-7,66 ppm. Ceilalți doi protoni singuratici (unul între diol și celălalt orto față de legătura imină) au dat un semnal multiplet la 7,52-7,54 ppm, în timp ce protonul cel mai apropiat de grupul para hidroxi și la două legături de carbon distanță de grupul imină a dat un semnal dublet la 6.38 ppm.

Figura 2

Structura chimică a DBH6 (compus 6) .

DEPT-Q este utilizat pentru diferențierea carbonilor primari, secundari, terțiari și cuaternari. În DEPT-Q, semnalele de metil (CH3) și metină (CH) apar în sus în faza pozitivă, în timp ce semnalele de metilen (CH2) și cuaternare apar în jos în faza negativă. Spectrul DEPT-Q al DHB6 (informații suplimentare) relevă prezența unor semnale de carbon în sens ascendent, reprezentând doar șase carboni de metilen în acest caz, care apar la 161,8, 159,1, 148,2, 136,7, 130,1 și 112,0, confirmând carbonații aromatici de metilen și șapte carboni cuaternari care apar la 148,2, 130,1, 129,2, 123,6, 116,9, 108,7 și 102,9. DEPT-Q pentru ceilalți compuși pot fi găsite în informațiile suplimentare.

3.1.4. Spectroscopia de masă

Spectroscopia de masă este utilizată pentru determinarea exactă a greutăților moleculare și fragmentarea compușilor folosind tehnici de ionizare . Compusul SA5 fenilhidrazona a fost unul dintre cei mai activi compuși după evaluarea antimicrobiană. Din spectrul de masă de ionizare prin electrospray (ESI), vârful ionului molecular în modul negativ a fost 301,0000 (M-H+), care este masa reală având un interval de toleranță de 0,24 (0,41%) față de masa teoretică de 302,2400. Acest lucru a confirmat greutatea moleculară a compusului SA5.

Spectroscopia de masă a fost utilizată pentru a confirma greutatea moleculară a unuia dintre cei mai activi compuși și, prin urmare, nu a fost aplicată celorlalți.

4. Evaluarea antimicrobiană

4.1. Concentrațiile minime inhibitorii (CMI)

Concentrația minimă inhibitorie (CMI) este cea mai mică concentrație a unui agent antimicrobian care ar inhiba creșterea vizibilă a agentului patogen după 24 h (bacterii) și 48 h (ciuperci) de incubare . CMI ale fenilhidrazonelor și a două antibiotice standard (ciprofloxacină și fluconazol) au fost evaluate cu ajutorul testului de diluție în microbromă împotriva unui panel de șase microorganisme patogene: Gram-negative , Gram-pozitive , și C. albicans (ciupercă, tulpină clinică).

Toți compușii au prezentat o activitate antimicrobiană slabă împotriva organismelor testate la concentrațiile de testare, așa cum se observă în tabelul 2. BP1 a prezentat cea mai mare activitate antimicrobiană dintre cei șase compuși împotriva organismelor de testare selectate. Cu toate acestea, BA2 a avut cea mai mică activitate antimicrobiană cu o CMI de 699 µM împotriva tuturor organismelor de testare. MHB3 a avut o CMI de 562 µM împotriva C. albicans și de 662 µM și peste 662 µM împotriva celorlalte organisme de testare. VL4 a înregistrat o CMI de 602 µM împotriva tuturor organismelor testate, cu excepția S. pneumoniae (CMI = 300 µM). CMI ale SA5 împotriva S. pneumoniae și K. pneumoniae au fost de 165 µM și, respectiv, 331 µM, în timp ce pentru S. aureus, E. coli, P. aeruginosa și C. albicans a avut o CMI mai mare de 662 µM. DHB6 a prezentat activitate împotriva S. pneumoniae, K. pneumoniae și C. albicans cu o CMI de 314 µM, în timp ce pentru S. aureus, E. coli și P. aeruginosa a avut o CMI de 628 µM și mai mare. Medicamentul antibacterian de referință utilizat a fost ciprofloxacina, iar CMI-urile înregistrate au fost de 2,36 µM împotriva P.aeruginosa, S. pneumoniae și K. pneumoniae, în timp ce pentru S. aureus și E. coli au fost înregistrate 4,72 µM. Medicamentul antifungic de referință utilizat a fost fluconazolul, iar CMI obținută a fost de 327 µM împotriva C. albicans. CMI a fenilhidrazonelor împotriva celor două organisme Gram-negative a variat de la 552 µM la 699 µM, în timp ce ciprofloxacina standard a fost de 4,72 și, respectiv, 2,36 µM (tabelul 2).

4.2. Activitatea de modulare a rezistenței

Tendința fenilhidrazonelor la sub-MIC-uri de a îmbunătăți activitățile unor antibiotice comerciale împotriva unor tulpini rezistente cunoscute a fost investigată prin testul de modulare a rezistenței. Din tabelele 2 și 3, BP1 (compusul 1) cu sub-MIC de 50 µM împotriva S. pneumoniae a scăzut MIC a ciprofloxacinei de la 2,36 la 1.078 µM, ceea ce reprezintă o reducere de 54,32% a CMI a ciprofloxacinei. BP1 a îmbunătățit, de asemenea, performanța ciprofloxacinei la sub-MIC de 50 µM împotriva K. pneumoniae de la 2,36 µM la 1,078 µM, ceea ce reprezintă o reducere de 54,32% a MIC a antibioticelor. Din nou, BP1 a modulat activitatea fluconazolului împotriva C. albicans de la 327 la 2,156 µM, ceea ce reprezintă o reducere de 99,34% a CMI a fluconazolului. În mod similar, BA2 a îmbunătățit activitatea ciprofloxacinei împotriva S. pneumoniae și a redus CMI a ciprofloxacinei de la 2,36 la 1,36 µM, ceea ce reprezintă o reducere de 42,37%. În plus, BA2 a modulat, de asemenea, activitatea fluconazolului la sub-MIC de 50 µM împotriva C. albicans și a provocat o reducere a MIC de la 327 la 1,23 µM, ceea ce indică o reducere de 99,6% a MIC.

MHB3 a modulat activitatea ciprofloxacinei față de S. pneumoniae și Klebsiella pneumoniae determinând o reducere a CMI a antibioticelor de la 2,36 la 1,29 µM. Această scădere a CMI a indicat o reducere de 45,33 %. MHB3 a arătat, de asemenea, modularea activității fluconazolului la sub-MIC de 50 µM împotriva Candida albicans și a scăzut MIC la 5,109 de la 327 µM, indicând o reducere maximă de 98,43%. VL4 a îmbunătățit performanța ciprofloxacinei la o concentrație sub-MIC de 50 µM împotriva S. pneumoniae și K. pneumoniae. CMI a antibioticului a scăzut de la 2,36 la 1,176 µM. în ambele cazuri. Această scădere a CMI a reprezentat o reducere de 50,17%. VL4 a modulat din nou performanța fluconazolului la sub-MIC de 50 µM împotriva C. albicans și a scăzut MIC la 1,176 µM de la 327 µM, ceea ce a arătat o reducere maximă de 99,64%.

În plus, compusul 5 (SA5) a modulat activitatea ciprofloxacinei la sub-MIC de 50 µM împotriva S. pneumoniae și K. pneumoniae. CMI a fost scăzută de la 2,36 la 1,29 µM în ambele cazuri, ceea ce a dus la o reducere de 45,34%. SA5 a modulat din nou performanța fluconazolului la sub-MIC de 50 µM împotriva C. albicans și a suprimat MIC-ul acestuia de la 327 la 1,29 µM, indicând o reducere bună de 99,61%. DHB6 (compusul 6) a modulat, de asemenea, activitatea ciprofloxacinei la o CMI sub 50 µM împotriva S. pneumoniae și K. pneumoniae și a redus CMI de la 2,36 la 1,23 µM în ambele cazuri, ceea ce reprezintă o reducere de 47,88% a CMI. DHB6 a modulat, de asemenea, activitatea fluconazolului la o concentrație sub-MIC de 50 µM împotriva C. albicans și a redus MIC de la 327 µM la 1,23 µM, ceea ce reprezintă o reducere de 99,62% a MIC. SA5 și BP1 au fost mai bune decât celelalte patru fenilhidrazone în ceea ce privește activitatea de modulare a rezistenței împreună cu ciprofloxacina, care a avut o CMI de 2,58 µM împotriva P.aeruginosa, urmată de BP1 (17,2 µM). Prin urmare, prezența unei grupări orto-hidroxi în SA5 și a unei grupări cetonice aromatice ar putea fi esențială pentru activitatea de modulare a rezistenței în combinație cu ciprofloxacina împotriva P.aeruginosa Gram-negativă și E. coli. În plus, prezența unei grupări meta-hidroxi (MHB3), a unei grupări hidroxi și metoxi (VL4) și absența unui substituent pe porțiunea benzaldehidică a BA2 au îmbunătățit, de asemenea, activitatea și ar putea fi luate în considerare pentru dezvoltarea viitoare a medicamentelor. K. pneumoniae, celălalt omolog Gram-negativ care provoacă infecții grave, a fost mai sensibil la fenilhidrazone la 138 până la 699 µM. Prin combinarea concentrațiilor subinhibitorii ale fenilhidrazonelor cu ciprofloxacina, bariera de rezistență a lui K. pneumoniae a fost redusă, permițând o CMI mult mai mică de 1,078 de la 5,46 µM, o tendință mai impresionantă decât cea a lui P. aeruginosa și E.coli.

Fenilhidrazonele au avut o activitate similară împotriva organismelor Gram-pozitive, variind de la 87,3 la 699 µM, ceea ce este, de asemenea, evident în ceea ce privește proprietățile de rezistență ale Staphylococcus aureus și Streptococcus pneumoniae.

5. Concluzie

O bibliotecă de șase fenilhidrazone noi a fost sintetizată și caracterizată cu succes: 1-(2, 4-dinitrofenil)-2-(difenilmetilenă) hidrazină , 1-benziliden-2-(2, 4-dinitrofenil) hidrazină , 3-(2-2-(4-dinitrofenil) hidrazono) metilfenol, 4-(2-(2, 4-dinitrofenil) hidrazono) metil)-2-metoxifenol , (Z)-2-(2(2, 4-dinitrofenil) hidrazono) metilfenol , și 4-(2-(2-(2, 4-dinitrofenilhidrazono) metil) benzen-1, 3-diol.

În cadrul proiectării și optimizării viitoare a medicamentelor, fenilhidrazonele pot fi luate în considerare ca și coloane vertebrale structurale datorită fezabilității lor sintetice și randamentului bun. Compușii au prezentat o proprietate antimicrobiană slabă, dar au demonstrat o acțiune puternică de modulare a rezistenței atunci când au fost combinați cu medicamentele standard. Activitățile standardelor s-au îmbunătățit semnificativ, cu o bună reducere a valorilor CMI.

Abbreviații

Disponibilitatea datelor

Datele cercetării sunt disponibile în arhiva Departamentului de Chimie Farmaceutică, Facultatea de Farmacie, Universitatea de Știință și Tehnologie Kwame Nkrumah.

Conflicte de interese

Autorii declară că nu există conflicte de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.

Contribuțiile autorilor

A.A., A.B., I.A., Y.D.B., C.D.K.A. și B.K.H. au conceput activitatea de cercetare și au pregătit manuscrisul. C.D. K.A., A.B. și A.A. au conceput și au efectuat sinteza compușilor. C.D.K.A., A.A. și I.A. au elaborat cadrul conceptual și au pregătit manuscrisul. C.D.K.A. și B.K.H. au interpretat rezultatele spectrale și au efectuat elucidarea structurii. Y.D.B. și A.A. au efectuat testul antimicrobian in vitro și au furnizat datele sale experimentale și interpretarea rezultatelor.

Recunoștințe

Autorii sunt foarte recunoscători întregului personal și tehnicienilor de la Departamentul de Chimie Farmaceutică, Facultatea de Farmacie, KNUST, Kumasi, Ghana, pentru sprijinul lor. Autorii îi mulțumesc foarte mult domnului Francis Amankwah de la Departamentul de Farmacie (Secția de Microbiologie), KNUST, pentru suportul tehnic.

Materiale suplimentare

Arhiva suplimentară conține toate spectrele. (Materiale suplimentare)