I.U.B.: 3.1.27.5
C.A.S.: 9001-99-4
Reacție enzimatică (imaginea se va deschide într-o fereastră nouă)
Ribonucleaza pancreatică (RNază) este o endoribonuclează. Ea catalizează scindarea legăturii fosfodiesterice dintre 5′-riboza unei nucleotide și gruparea fosfat atașată la 3′-riboza unei nucleotide pirimidinice adiacente. Această scindare formează un fosfat 2′,3′-ciclic, care este apoi hidrolizat în fosfatul 3′-nucleozidic corespunzător.
RNaza se găsește în cea mai mare cantitate în pancreasul rumegătoarelor (Barnard 1969). Componenta majoră a enzimei cristaline este RNază A; o componentă minoră este RNază B. RNază B este forma glicozilată a RNazei A (Beintema et al. 1976).
Istoric:
Lucrarea lui Jones din 1920 este de obicei citată ca fiind „începutul” ribonucleazei pancreatice (Richards și Wycoff 1971). RNaza a fost izolată de Dubos și Thompson în 1938 și cristalizată de Kunitz în 1940.
În 1947, Worthington a fost prima companie care a fabricat RNază cristalină înalt purificată. La începutul anilor 1950, compania Armour a preparat enzima cristalină brută și a oferit-o la un preț foarte accesibil. De-a lungul anilor 1960 și 1970, RNaza A a fost preferata pentru studiu, în primul rând pentru că este remarcabil de termostabilă și prezentă în concentrație mare într-o sursă accesibilă, pancreasul bovin. Aceste studii au dus la elucidarea structurii cristaline (Anfinsen 1959, Groves 1966 și Scheraga 1967), la determinarea secvenței de aminoacizi (Smyth et al. 1963), la identificarea mecanismului catalitic (Beers 1960) și la clarificarea căilor de pliere (Hantgan et al. 1974). RNaza A a fost prima enzimă și a treia proteină pentru care a fost determinată o secvență corectă de aminoacizi (Raines 1998).
Patru premii Nobel au fost acordate pentru lucrări asociate cu studiile asupra RNazei (Anfinsen, Moore, Stein și Merrifield). Literatura vastă și numeroasele studii au făcut din RNază cea mai studiată enzimă a secolului XX (Raines 1998).
Lucrări recente continuă să investigheze sinteza și maturarea RNazei în reticulul endoplasmatic al celulelor vii (Geiger et al. 2010). De asemenea, multe lucrări sunt în continuare dedicate studierii replierii și agregării RNazei (Benito et al. 2008, Iwaoka et al. 2008 și Arai et al. 2010). Se studiază rolul enzimei în dezvoltarea cancerului și în reglarea genelor (Shlyakhovenko 2009), iar aceasta este în curs de dezvoltare ca agent chimioterapeutic pentru cancer (Chao et al. 2010).
Specificitate:
RNaza A este specifică pentru legăturile nucleozidice pirimidinice (Volkin și Cohn 1953). Se crede că reacția are loc în două etape. În prima etapă, legătura 3′,5′-fosfodiester este scindată, generând în același timp un intermediar 2′,3′-fosfodiester ciclic. În a doua etapă, fosfodiesterul ciclic este hidrolizat în gruparea 3′-monofosfat. Prima etapă este nespecifică în ceea ce privește baza azotată a substratului; cu toate acestea, a doua etapă este absolut specifică pentru nucleotidele pirimidinice cu 2′,3′-fosfați ciclici terminali. RNaza B are aceeași specificitate ca RNaza A atât față de ctidilatul ciclic, cât și față de ARN de drojdie (Plummer și Hirs 1963). RNaza A prezintă o preferință pentru substraturi mai mari (Nogués et al. 1995).
Enzima clivează la reziduurile de citetidină de două ori mai repede decât la reziduurile de uridil (Richards și Wyckoff 1971). S-a constatat că Thr45 este cel mai important pentru medierea specificității pirimidinei, atât prin formarea de legături de hidrogen cu bazele pirimidinice, cât și prin excluderea sterică a bazelor purinice (del Cardayré și Raines 1994). Lanțul lateral al lui Asp83 este important pentru stabilizarea stării de tranziție în timpul scindării substraturilor care conțin uridină; acest reziduu nu are nici un efect asupra cineticii scindării citidinei (del Cardayré și Raines 1995).
Compoziție:
Forma proteinei seamănă cu cea a unui rinichi, cu reziduurile situsului activ așezate în fantă (Richardson 1981, și Raines 1998). Structura secundară conține foițe beta lungi cu patru catene antiparalele și trei alfa-helice scurte (Raines 1998). RNază A conține patru legături disulfidice, care sunt esențiale pentru stabilitatea enzimei native. Două dintre aceste legături disulfidice se află între o alfa-helix și o foaie beta și contribuie mai mult la stabilitatea termică decât celelalte două (Klink et al. 2000). RNază B este o glicoproteină care conține la Asn34 o singură oligozaharidă compusă din șase resturi de mannoză și două resturi de N-acetilglucozamină (Tarentino et al. 1970).
Caracteristici moleculare:
RNaza A este o proteină mică, enzima matură având doar 124 de resturi de aminoacizi, fără niciun carbohidrat atașat. RNaza A conține 19 din cei 20 de aminoacizi, lipsind doar triptofanul (Nogués et al. 1995, și Raines 1998). Structura tridimensională a RNazei A este complet codificată de secvența sa de aminoacizi (White și Anfinsen 1959, și Raines 1998). Toate cele opt gene umane asemănătoare RNază A sunt localizate pe cromozomul 14. Fiecare dintre ele codifică o secvență de semnal secretor și conține o triadă catalitică invariabilă formată din două histidine și o lizină cu un motiv conservat (CKXXNTF) (Marshall et al. 2008).
Secvențele de aminoacizi ale multor omologi ai RNazei A au fost identificate, ceea ce face din RNazei A un sistem model pentru evoluția moleculară a vertebratelor (Dyer și Rosenberg 2006). Pe baza secvențelor și a distribuției acestora într-o serie de specii s-a stabilit că RNaza A este o proteină modernă care evoluează rapid (Doolittle 1992, și Raines 1998).
Numărul de accesare a proteinei: P61823
Clasificarea CATH (v. 3.2.0):
- Clasa: Proteina proteinelor: Alfa-Beta
- Arhitectura: Roll
- Topologie: Proteină P-30
Greutate moleculară:
- RNază A: 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNază B: 14,700 ± 0,3 (Plummer și Hirs 1963)
Ph-ul optim: RNază A: 7,0-7,5 (Brown și Todd 1955)
Punctul izoelectric:
- RNază A: 9,3 (Ui 1971)
Coeficient de extincție:
Coeficient de extincție:
- RNază A și B: 8,640 cm-1M-1 (Teoretic)
- RNază A: E 1%, 280 = 7,3 (Worthington RNase A)
- RNază B: E 1%, 280 = 5.77 (Teoretic, RNază B)
Reziduuri ale situsului activ:
- Histidină (H12, H119)
- Lizină (K41)
Activatori:
- Clorură de sodiu (Weickmann et al. 1981)
- Sulfat (Moosavi-Movahedi et al. 2006)
Inhibitori:
- Ioni de metale grele
- Inhibitor de ribonuclează (RI), o proteină de 50 kDa care constituie ≤ 0,5 %.01% din proteinele din citosolul celulelor de mamifere (Takahashi 1967)
- Complecși de uridină-vanadat (Lindquist et al. 1973)
Aplicații:
- Îndepărtarea ARN-ului în timpul izolării ADN-ului
- Analiza secvenței de ARN
- Sesizări de protecție ARNază
- Cuantificarea sau cartografierea ARN-ului
- Purificarea ADN-ului plasmidic
- Insolarea ADN-ului genomic
- Marcator de greutate moleculară
.