Reconstrucția tridimensională a aparatului de hrănire al căpușei Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae): o nouă perspectivă asupra mecanismului de hrănire cu sânge

Imaginea cu raze X a femelei I. ricinus

Aici, arătăm că configurația CRYTUR cu raze X (bazată pe microfocusul X-RayWorx, sursa de raze X și detectorul de raze X CRYCAM) este foarte potrivită pentru a oferi o observare rapidă și nedistructivă a structurilor interne impregnate cu osmiu ale căpușelor femele. Figura 1A arată mușchii retractori chelicerali care ajung până în zona celei de-a doua perechi de picioare, grosimea cuticulei, mușchii din interiorul picioarelor și palpele (Fig. 1A, Filmul 1). Modelul 3D obținut din imaginile de proiecție cu raze X 2D a oferit informații spațiale suplimentare despre structurile superficiale ale capitulului femelei (Fig. 1B), comparabile cu imaginile de previzualizare prin SEM (Fig. 1D), cu posibilitatea rezultată de a vizualiza, de asemenea, unele structuri interne (de exemplu, mușchii, bazele chelicerelor și faringele) la diferite felii virtuale (Fig. 1B). Rezoluția tomografiei cu raze X a fost de 8,060 µm și a fost calculată pe baza analizei Fourier de la o felie virtuală reconstruită în câmpia laterală prezentă în mijlocul obiectului reconstruit. Am construit un grafic al spectrului de putere mediat radial și, pe baza criteriului Rayleigh, evaluăm semnalul de graniță de separare de zgomot la 8,94% din distanța dintre pragul de zgomot și valoarea de vârf. Deoarece modelul cu raze X a fost reconstruit din imaginile de proiecție în intervalul de la 0° la 180° cu pas de 10°, rezoluția este aproape izotropă din punct de vedere tehnic. Cu toate acestea, această rezoluție nu a fost suficientă pentru observarea organelor bucale ale nimfelor (Fig. 1C,D, a se vedea comparația dimensiunilor organelor bucale atât ale femelelor, cât și ale nimfelor la aceeași mărire).

Secțiune serială SEM

Modelul 3D al aparatului de hrănire al nimfei de I. ricinus care a fost reconstruit din secțiuni seriale ultrafine de rășină a evidențiat relațiile dintre salivar și canalul de hrană cu stilii capitulari (chelicerae, hypostome) și alte structuri asociate, în principal mușchi (Fig. 2, filmele 2 și 3)14.

În exteriorul capitulului, saliva și masa de sânge sunt expulzate/aspirate într-o fantă îngustă, canalul preoral, formată între canelura hipostomei pe partea ventrală și chelicerele pe partea dorsală (Fig. 2A). La Rhipicephalus (fost Boophilus) microplus, o membrană subțire, numită și jgheab, acoperă șanțul hipostomal12. Interesant este faptul că această structură lipsește la Ixodes hexagonus9, Haemaphysalis longicornus15 și I. ricinus. În interiorul capitulului, saliva/sângele continuă în cavitatea salivarului, iar această cale comună se termină printr-o separare a unui canal alimentar de salivar (Fig. 2A,B). Din partea dorsală a căpușei, canalul alimentar este situat sub salivarium. Salivarul nu este o structură fixă permanentă, ci este creat prin plasarea chelicerelor deasupra părții dorsale a hipostomului. Canalul alimentar se separă de calea comună prin deschiderea în faringe. Acoperișul său este format la început de o lamelă minusculă (Fig. 2B, săgeată verde) care se lărgește într-o tijă scurtă în adâncimea capitulului (Fig. 2C,I verde) și continuă ca o placă mai mare sclerotizată în formă de aripă (cunoscută și sub numele de alae) (Fig. 2E,I, verde). Toate aceste structuri formează împreună un labrum. În partea inferioară a labrumului, există un proces asemănător unui dinte adiacent orificiului faringian (Fig. 2C,E, săgeți negre). Această structură asemănătoare unui dinte a fost descrisă la I. hexagonus, I. holocyclus și Rhipicephalus microplus9,12,16. Procesul asemănător unui dinte pare să se potrivească într-o canelură a orificiului faringian, prin urmare se presupune că este o parte importantă a valvei faringiene. Identificarea acestui proces asemănător unui dinte drept labrum este justificată de asemănarea sa cu labrumul căpușelor argaside, care se extinde, de asemenea, de la acoperișul faringian în canalul alimentar13,16. Structura anatomică a canalului alimentar, a micului labrum și a valvei la I. ricinus este în concordanță cu procesul lent de hrănire la aceste căpușe, în care impulsurile lungi de supt alternează cu impulsurile de secreție salivară în timpul perioadei lungi de hrănire cu sânge. Cu toate acestea, la căpușele moi, labrumul se extinde distal pe întreaga lungime a canalului alimentar. Acest lucru este în concordanță cu procesul rapid de hrănire la aceste căpușe în care fluturarea rapidă a labrumului este sincronizată cu suptul și salivarea rapidă pentru a se hrăni în doar 1-2 ore13. Pe baza observațiilor noastre EM, această parte anterioară a acoperișului faringian nu a fost conectată cu mușchii și, probabil, formează o parte staționară (de susținere) a valvei (Fig. 2B). Acoperișul faringian este conectat la plăcile subhipostome care creează părțile laterale și o podea a faringelui (Fig. 2C săgeți albe). Aceste plăci sunt conectate la benzile musculare mari de dilatare atașate pe părțile lor opuse la cuticula ventrală. Mușchii dilatatori anteriori ai faringelui (ADM, reprezentați în Fig. 2C,E,I ca structuri de culoare roz deschis) sunt situați numai în partea anterioară a faringelui, iar contracția/relaxarea lor permite deschiderea/închiderea valvei din orificiul faringian9,12. ADM sunt atașate de colțul superior și de laturile laterale profunde ale părții anterioare a faringelui. Partea mediană a pereților faringelui este asociată cu un alt grup de mușchi dilatatori a căror contracție extinde lateral lumenul faringian. Acești mușchi dilatatori laterali ai faringelui (LDM) pot fi văzuți în Fig. 2G și ca structuri de culoare roz închis în Fig. 2I,J. LDM permite lărgirea masivă a lumenului faringian posibil și datorită peretelui în formă de Y dublu în partea anterioară (Fig. 2G) și a peretelui în formă de Y triplu în partea posterioară a faringelui într-o secțiune transversală (Fig. 2H) descrisă de Arthur et al.9 și Sonenshine și Anderson13. Alternanța de contracție și relaxare a ambelor grupe de mușchi dilatatori dilată faringele, sincronizată cu deschiderea valvei anterioare, creând un impuls puternic de supt. Relaxarea LDM, după închiderea valvei faringiene, strânge faringele și împinge sângele ingerat posterior în esofag și în intestinul mijlociu. Sincronizarea în timp a deschiderii/închiderii orificiului faringian, coordonată cu deschiderea și închiderea valvei faringiene și cu comprimarea/alărgirea lumenului din partea mijlocie a faringelui, permite suptul, precum și deplasarea alimentelor în esofag și, de asemenea, previne regurgitarea sângelui înapoi în gazdă9,12. Învelișul interior al faringelui este sclerotizat, în timp ce peretele esofagului este căptușit cu celule epiteliale (Fig. 2A). Esofagul trece prin synganglion și se unește cu intestinul mijlociu (date nesemnalate).

Salivarul este o cavitate mare situată între faringe și chelicerae (Fig. 2A-E). Partea anterioară a salivarului este împărțită atât pentru trecerea sângelui, cât și a salivei, apoi faringele este separat de podeaua salivarului de către o lamelă mică (vezi mai sus). Acoperișul și laturile laterale ale salivarului sunt întărite de placa chelicerală sclerotizată (ChP în Fig. 2C,E,F și structura roșie prezentată în Fig. 2M) care se extinde mai departe în cavitatea corpului căpușei. În partea posterioară a salivarului, laturile laterale ale acestei plăci sunt conectate la mușchii fixați la capetele opuse de laturile laterale ale cavității corpului căpușei. Acești mușchi laterali ai salivarului (LMS), pot fi văzuți în Fig. 2E,F,K,L marcați cu violet deschis. Contracția mușchilor aplatizează placa, care este strâns legată de peretele salivarului, ceea ce duce la îngustarea/închiderea spațiului interior al salivarului, însă numai în partea sa posterioară, în spatele separării faringelui.

În plus, podeaua extremității posterioare a salivarului este conectată la un mic grup de mușchi oblici (mușchi atașați de podeaua salivarului, MS în Fig. 2E,F,J,N, marcați cu albastru deschis) uniți în părțile opuse cu partea superioară a părții anterioare a faringelui. Acești mușchi permit mișcarea în sus și în jos a părții posterioare a podelei salivarului. Acești mușchi au fost descriși la femela I. holocyclus16. Posibilitatea ca podeaua salivarului să poată fi coborâtă sau ridicată a fost propusă anterior în legătură cu o explozie rapidă de salivă, pe baza unei înregistrări a semnalelor electrice în timpul înghițiturii la R. microplus și Dermacentor andersoni12,17,18,19,20. În timpul salivării lui R. microplus, s-au observat deviații rapide (până la 30 pe secundă) în jos ale conductivității, urmate de vârfuri mai mari la sfârșitul salivării. O explicație pentru aceste măsurători este reprezentată de contracțiile mușchilor din partea anterioară a faringelui, însoțite de o pulsație similară a membranei de deasupra canalului alimentar (jgheab hipostomal) care deschide un canal pentru expulzarea salivei20. Presupunem că micii mușchi oblici atașați de podeaua salivarului pot genera vibrații care să faciliteze mișcarea salivei. Cu toate acestea, și mușchii laterali care influențează diametrul spațiului interior al salivarului pot participa la expulzarea salivei în afara aparatului bucal (nu sunt incluși în animație). Sugerăm că mișcarea chelicerelor în interiorul pielii gazdei poate contribui, de asemenea, la expulzarea salivei din salivariu în pielea gazdei. Bazele chelicerale (ChB în Fig. 2A,B) sunt situate direct deasupra salivarului (din vedere dorsală) și speculăm că aceste structuri pot comprima local salivarul pentru a ajuta la expulzarea salivei. Extinderile chelicerelor, care au fost ușor asincrone, au fost observate prin microscopie intra-vitală cu doi fotoni direct în interiorul locului de hrănire în timpul întregii perioade de îngurgitare a I. scapularis21. Am observat că chelicerele încep să se miște într-o manieră ușor asincronă după aplicarea pilocarpinei pe cuticula dorsală a femelelor de I. ricinus nealimentate și parțial alimentate (filmele 5 și, respectiv, 6). Bazele chelicerale (ChB în Fig. 2A,B) sunt situate direct deasupra salivarului (din vedere dorsală) și putem specula că aceste structuri pot extinde sau comprima salivarul și pot ajuta la expulzarea salivei. Este bine cunoscut faptul că aplicarea pilocarpinei, un medicament colinergic non-endogen, induce salivarea indirect prin intermediul sistemului nervos central al căpușei22 , în timp ce efectul său asupra altor țesuturi ale căpușei rămâne obscur. Prin urmare, nu putem exclude mișcarea mediată de pilocarpină a chelicerelor în experimentele noastre ca fiind un efect suplimentar al acestui medicament la căpușe. Bockenstedt et al. au sugerat că chelicerae forțează înapoi fibrele de colagen care pot comprima locul de hrănire, confirmând în mare măsură ipotezele noastre de expulzare a salivă mediată de chelicerae către gazdă21.

Cu puțin înainte de capătul cavității salivare, canalele salivare pereche intră în colțurile sale laterale12. Ambele canale salivare sunt închise într-o foaie de țesut (TSD în Fig. 2C,E,F,M,N, violet închis) care, probabil, fixează în mod flexibil canalele salivare la colțurile laterale ale salivarului.

Simularea salivației și a suptului de sânge pe baza modelului 3D

În timpul procesului de hrănire la căpușele ixodide, salivația alternează cu suptul lent sau rapid al sângelui și poate include o perioadă de repaus. Procentele de timp petrecute de fiecare activitate în timpul îngurgitării femelei sunt variabile și se bazează pe momentul zilei, mărimea căpușelor etc.18. În filmul 4, am animat atât canalul alimentar, cât și canalul pentru trecerea salivei cu structurile asociate și arătăm modul în care funcționează aceste structuri. Procesul de hrănire al majorității căpușelor ixodide începe cu secreția de substanțe asemănătoare cimentului, care permite fixarea căpușei în pielea gazdei și sigilează spațiul dintre leziunea de hrănire și piesele bucale inserate23,24,25. Perioada de salivare poate fi încheiată de o scurtă explozie de salivă16,17,18,19. Expulzarea salivei este probabil facilitată de vibrația părții posterioare a podelei salivarului; este posibil să intervină și mișcarea bazelor chelicerale (filmul 6). Înainte de începerea suptării sângelui, orificiul părții posterioare a salivarului este îngustat de mușchii laterali întinși între acoperișul salivarului și peretele lateral al corpului căpușei. Această acțiune este urmată de deschiderea valvei faringiene și de o expansiune a faringelui anterior cauzată de contracția mușchilor dilatatori anteriori. Ulterior, partea mediană a faringelui este întinsă de-a lungul axei sale longitudinale, iar sângele este atras în faringe. Valva faringiană anterioară se închide înainte ca peretele faringian să fie contractat din nou, iar sângele este împins posterior spre esofag. Această undă peristaltică se repetă până când începe salivarea. La începutul salivației, mușchii restrictori laterali ai salivarului se relaxează, lărgind astfel cavitatea salivarului. Coborârea și ridicarea repetată a acoperișului salivarului în partea sa posterioară facilitează probabil livrarea salivei către canalul preoral.

.