Activitatea PHMB asupra membranei celulare bacteriene

Dacă activitatea antibacteriană a PHMB (Fig. 1a) se datorează întreruperii membranei, așa cum s-a raportat pe scară largă6,7,8,9,10, ar fi de așteptat ca acesta să permeabilizeze barierele celulelor bacteriene la concentrații inhibitoare și subinhibitoare de creștere. Pentru a testa acest model, am stabilit mai întâi concentrațiile minime inhibitorii (CMI) și proprietățile de distrugere în timp pentru PHMB împotriva Escherichia coli (tulpinile K-12 și MG1655) și Salmonella enterica serovar Typhimurium (tulpina LT2). Așa cum s-a raportat anterior2,4, PHMB a prezentat proprietăți puternice de inhibare a creșterii și de combatere a cancerului (tabelul suplimentar 2 și figura suplimentară 1). De asemenea, după tratament, am examinat celulele cu ajutorul microscopiei optice. În mod neașteptat, concentrațiile inhibitoare de creștere ale PHMB nu au lizat celulele, așa cum a fost monitorizat prin microscopie cu câmp luminos. Pentru a evalua deteriorarea barierei celulare care ar putea fi invizibilă la microscopie, culturile de E. coli K-12 au fost crescute până la faza de log mediu, tratate cu PHMB în prezența sondei fluorescente de integritate a membranei SYTOX®Green și apoi monitorizate prin fluorimetrie. Această sondă este utilă ca indicator al deteriorării membranei, deoarece, în mod normal, este exclusă din bacteriile intacte, iar randamentul cuantic al fluorescenței sale crește la legarea ADN-ului. Prin urmare, este de așteptat ca bacteriile intacte să prezinte o fluorescență scăzută, iar fluorescența să crească în urma deteriorării barierei celulare16. După cum s-a anticipat, culturile de E. coli proaspăt crescute au prezentat creșteri mari ale fluorescenței în urma tratamentului cu polimixina B, un perturbator cunoscut al peretelui celular, sau a tratamentului termic (Fig. 1b). În mod neașteptat, tratamentul cu PHMB a dus la niveluri relativ mai scăzute de fluorescență. În mod surprinzător, concentrațiile mai mari de PHMB au dus la o fluorescență la niveluri de fond. Aceste observații nu sunt compatibile cu întreruperea membranei ca principal mecanism antibacterian și, prin urmare, au ridicat îndoieli suplimentare cu privire la modelul stabilit.

Figura 1
figura1

Efectele PHMB asupra permeabilității membranei celulare și a intrării în bacterii.

(a) Structura polihexametilen biguanidei (PHMB; CAS# 27083-27-8); denumiri chimice alternative: polihexanidă; exemple de denumiri comerciale: Vantocil™, Cosmocil™, Cosmocil™, Baquacil™, Prontosan®. A se vedea tabelul suplimentar 1 pentru detalii suplimentare. PHMB este compusă din unități repetitive de biguanidină bazică conectate prin lanțuri de hidrocarburi hexametilenice, oferind o structură cationică și amfipatică cu o capacitate ridicată de legătură de hidrogen, interacțiuni electrostatice și hidrofobe. Preparatele de PHMB cuprind de obicei polimeri de lungime mixtă cu grupe terminale de amină, guanidină și cianoguanidină (de exemplu, media n = 13,8, 3,035 g/mol44) (b) Efectele PHMB, ale căldurii, ale polimixinei B (control pozitiv) și ale triclosanului (control negativ) asupra permeabilității celulelor la SYTOX®Green. Valorile MIC pentru antibacteriile testate sunt indicate cu săgeți verticale colorate, în partea de sus. (c) Microscopie cu fluorescență a intrării PHMB-FITC în diverse bacterii. PHMB-FITC (2 μg/mL) a fost adăugat la culturile bacteriene, iar celulele au fost contracolorate cu DAPI. (d) Imagine confocală care arată localizarea PHMB-FITC (verde) în B. megaterium; bacteriile au fost contracolorate cu sonda de localizare a membranei agglutinină din germeni de grâu (WGA) conjugată cu Alexa Fluor-555 (roșu) și vizualizate ca celule vii (sus) și fixate (jos); bara = 5 μm. (e) Analiza grafică a profilului profilului de intensitate a fluorescenței de localizare celulară a fluorescenței PHMB-FITC și WGA (linia albă a indicat secțiunea transversală utilizată pentru analiză). Linia verde indică nivelurile de FITC și poziția (în principal în interiorul celulei). Linia roșie indică nivelurile de WGA și poziția (în principal în interiorul membranei).

PHMB intră în bacterii

Dacă ținta primară a PHMB nu este reprezentată de barierele celulare bacteriene, sau nu exclusiv de barierele celulare, atunci probabil că acționează la nivel intern, ceea ce ar necesita intrarea în celule. Pentru a testa intrarea bacteriană, am sintetizat un conjugat PHMB-FITC (Fig. suplimentară 2a,b) și am evaluat absorbția în bacteriile Gram-pozitive (Staphylococcus aureus), Gram-negative (Escherichia coli și Salmonella enterica serovar Typhimurium) și Gram-negative (Mycobacterium smegmatis) prin microscopie și citometrie de flux (Fig. 1c, Fig. suplimentară 3). S-a observat o puternică fluorescență verde asociată celulelor la toate speciile testate (Fig. 1c). Pentru a examina mai amănunțit localizarea celulară, bacteria de dimensiuni mari Bacillus megaterium a fost tratată cu PHMB-FITC, contracolorată cu aglutinină din germeni de grâu (WGA-red) care localizează membrana și examinată prin microscopie cu fluorescență (Fig. 1d). Intrarea în celule a fost observată atât în celule vii, cât și în celule fixate, iar o analiză a profilului intensității fluorescenței arată că PHMB-FITC s-a localizat în citoplasmă, fără a se acumula la bariera celulară (Fig. 1e).

Observarea faptului că PHMB intră în celule la concentrații mici de micrograme/mL sugerează că poate intra în celule vii. Pentru a investiga dacă absorbția PHMB în bacterii necesită metabolismul energetic, culturile de E. coli în fază logaritmică medie au fost incubate la 37 °C, sau la 4 °C timp de 2 ore pentru a reduce nivelul ATP celular. Ulterior, celulele au fost tratate cu PHMB-FITC (0-6 μg/ml) și incubate în continuare la gheață timp de 2 ore. Fluorescența PHMB-FITC asociată celulelor a fost cuantificată prin fluorimetrie (figura suplimentară 3b). Celulele menținute la 4 °C au prezentat o absorbție redusă de PHMB-FITC în comparație cu celulele incubate la 37 °C, în concordanță cu un proces de absorbție celulară dependent de energie. De asemenea, au fost observate bacterii verzi fluorescente și mobile în mai multe momente de timp în timpul tratamentului cu PHMB (Fig. suplimentară 3). Deoarece motilitatea bacteriană este dependentă de energie17, dovezile indică faptul că PHMB-FITC intră în celulele active din punct de vedere metabolic. Prin urmare, PHMB pătrunde în diverse bacterii, iar intrarea a fost observată în celulele motile.

PHMB oprește diviziunea celulară și condensează cromozomii bacterieni

Când am examinat E. coli prin microscopie, am observat că celulele tratate cu PHMB au prezentat adesea o morfologie alungită, care poate fi caracteristică inhibării diviziunii celulare (Fig. 2a). Pentru a măsura efectele PHMB asupra alungirea celulelor, am titrat PHMB în culturile în creștere de E. coli tulpina SS996 (vide infra) și am măsurat lungimile celulelor. La concentrațiile inhibitoare de creștere, peste 80% din celule s-au alungit (Fig. 2b; tabelul suplimentar 2). De asemenea, am observat că E. coli tratate cu concentrații inhibitoare de creștere de PHMB sau PHMB-FITC, urmate de colorarea cu DAPI, au prezentat foci fluorescente albastre în apropierea centrului celular (Fig. 2c). Aceste structuri semănau cu nucleoizi18. Pentru a facilita vizualizarea focarelor de ADN, am generat populații filamentoase/multinucleate de E. coli prin inhibarea diviziunii celulare prin reducerea la tăcere prin ARN a genei esențiale pentru diviziunea celulară ftsZ19. Reducerea la tăcere a ARN-ului a fost selectată pentru acest experiment deoarece permite reprimarea specifică și controlabilă a traducerii transcriptelor genelor esențiale20. Genele care sunt esențiale pentru creștere nu pot fi eliminate prin metode de întrerupere a genomului, deoarece acest lucru ar avea ca rezultat tulpini neviabile. În absența PHMB, celulele filamentoase au prezentat o colorare uniformă cu DAPI, în timp ce celulele tratate cu PHMB au prezentat „șiruri de mărgele” albastre (Fig. 2d). În mod similar, la bacteria Gram-pozitivă de dimensiuni mari B. megaterium am observat focare colorate cu DAPI în urma tratamentului cu PHMB (Fig. 2e). Aceste rezultate, atât la speciile Gram-negative, cât și la cele Gram-pozitive, arată că expunerea la PHMB duce la condensarea cromozomilor în cadrul bacteriilor.

Figura 2
figura2

Alungirea celulară mediată de PHMB și condensarea cromozomilor în bacterii.

(a) E. coli a fost tratată cu PHMB timp de 90 de minute și examinată prin microscopie cu câmp luminos. (b) Lungimea medie a celulelor în funcție de concentrația de PHMB. MIC (săgeată) este indicată. (c) Modelul de distribuție a cromozomilor în celule în urma tratamentului cu PHMB-FITC. Culturile de E. coli, tulpina K-12 au fost tratate cu PHMB-FITC, contracolorate cu DAPI și examinate prin microscopie cu fluorescență. Cromozomii apar sub forma unor focare condensate colorate cu DAPI; mai evidente în imaginea mărită. (d) Modelul de distribuție a cromozomilor în E. coli filamentoasă/multinucleată în urma expunerii la PHMB. Reducerea la tăcere prin ARN a expresiei ftsZ a fost utilizată pentru a opri diviziunea celulară, iar celulele au fost apoi netratate sau tratate cu PHMB, colorate cu DAPI și examinate prin microscopie cu fluorescență. (e) Modelul de distribuție a cromozomilor în celulele B. megaterium care au fost netratate sau tratate cu PHMB, colorate cu DAPI și WGA-roșu și examinate prin microscopie cu fluorescență.

Efectele antibacteriene mediate de PHMB sunt independente de căile de răspuns la stres

Alungirea celulară și condensarea cromozomilor sunt morfologii caracteristice care sunt adesea asociate cu răspunsul bacterian SOS21,22. Prin urmare, am considerat că aceste efecte ar putea implica acest răspuns. Cu toate acestea, în cazul efectelor mediate de PHMB, un răspuns SOS părea puțin probabil. În primul rând, răspunsul SOS este asociat, de obicei, cu deteriorarea ADN-ului și nu există dovezi privind efectele genotoxice sau epigenetice mediate de PHMB23. În al doilea rând, condensarea observată în urma reducerii la tăcere a ftsZ și a tratamentului cu PHMB a avut loc într-o tulpină recA- (TOP10), care este un mutant de răspuns SOS. Cu toate acestea, mecanismele antimicrobiene sunt, în mod notoriu, dificil de descifrat și pot implica mecanisme multiple. Prin urmare, am decis să evaluăm posibila implicare a unui răspuns SOS și a altor căi de răspuns la stres folosind o tulpină reporter SOS și un panel de mutanți ai căilor de răspuns la stres din E. coli.

Pentru a testa dacă efectele PHMB mediate de PHMB asupra alungirea celulelor și condensarea cromozomilor sunt modificate de mutații ale căilor de răspuns SOS, am evaluat răspunsurile morfologice în trei tulpini mutante de E. coli. Tulpina SS996 este capabilă să inițieze un răspuns SOS, dar, din cauza unei mutații sulB, răspunsul nu duce la inhibarea diviziunii celulare. Acest lucru se datorează faptului că SS996 are o alelă mutantă a ftsZ (sulB103), al cărei produs este insensibil la acțiunea inhibitorului de diviziune celulară SulA24 indus de SOS. Tulpina JW2669 nu produce RecA funcțional și, prin urmare, este deficitară pentru SOS. Tulpina AB2474 are o mutație în reprimatorul LexA care îl face să nu poată fi eliminat de RecA și, prin urmare, nu este capabilă să inducă un răspuns SOS (detalii suplimentare despre tulpini sunt prezentate în figura 3 și în tabelul 3 din informațiile suplimentare). Culturile aflate în faza medio-log au fost tratate cu PHMB, colorate cu DAPI și observate la un microscop cu fluorescență. Așa cum s-a observat la E. coli K-12, tulpinile mutante au prezentat morfologii alungite și cromozomi condensați în urma tratamentului cu PHMB (Fig. 3a). Prin urmare, diviziunea celulară mediată de PHMB și efectele asupra structurii cromozomilor apar independent de un răspuns programat SOS.

Figura 3
figura 3

Efectele PHMB asupra răspunsurilor SOS bacteriene.

(a) Condensarea cromozomului în tulpinile de E. coli SS996 (sulB103; mutant FtsZ insensibil la SulA), JW2669 (recA-; knock-out al recA) și AB2474 (lexA1, mutație care împiedică inducerea răspunsului SOS) după tratamentul cu PHMB timp de 2 ore. Celulele au fost colorate cu DAPI pentru a evidenția ADN-ul. (b) Expresia reporterului de răspuns SOS, cuantificată prin fluorimetrie. Tulpina E. coli SS996 purtătoare a unei fuziuni cromozomiale sulAp-gfp a fost netratată sau tratată cu PHMB, mitomicină C, un inductor SOS cunoscut, sau triclosan, care nu induce un răspuns SOS. Valorile MIC față de SS996 au fost PHMB, 0,75 μg/mL; triclosan, 2 μg/mL; mitomicina C, 0,06 μg/mL, iar aceste valori au fost utilizate pentru a calcula %MIC.

Pentru a măsura mai direct dacă PHMB induce un răspuns SOS, am utilizat tulpina E. coli SS996, care este o tulpină reporter care conține un sistem cromozomal de răspuns/reporter SOS sulAp-gfp24,25. Dacă un răspuns SOS este cauzat de PHMB, atunci expunerea la PHMB ar trebui să inducă expresia GFP în această tulpină. Culturile de SS996 au fost tratate cu PHMB timp de 18 ore și apoi s-a măsurat fluorescența verde. Mitomicina C, care deteriorează ADN-ul, a fost inclusă ca martor pozitiv, iar triclosanul, care inhibă biosinteza acizilor grași, a fost inclus ca martor negativ. Așa cum era de așteptat, mitomicina C a indus o creștere mare a expresiei GFP, iar triclosanul nu a indus expresia GFP. Spre deosebire de mitomicina C, PHMB nu a indus expresia GFP, ceea ce indică faptul că PHMB nu induce un răspuns SOS (Fig. 3b).

Am testat în continuare dacă tulpinile cu răspunsuri SOS defectuoase sau dereglate diferă în ceea ce privește susceptibilitatea la PHMB. Pentru a testa efectele mediate de recA asupra susceptibilității, am folosit o tulpină de E. coli care nu are recA (JW2669) și o tulpină care supraexprimă recA la adăugarea inductorului IPTG (ASKA JW2669) și am determinat valorile MIC. Nici suprimarea, nici supraexprimarea indusă a recA nu au modificat sensibilitatea la PHMB (Informații suplimentare, tabelul 3, rânduri umbrite în gri închis). În schimb, tulpina recA- a fost de 2 ori mai sensibilă la acidul nalidixic, medicament care induce răspunsul SOS, iar supraexprimarea recA a redus sensibilitatea la acidul nalidixic de 8 ori. Pentru a testa efectele mediate de lexA asupra susceptibilității la PHMB, am utilizat tulpina lexA1(Ind-) AB2474, care nu este capabilă să inducă un răspuns SOS. În raport cu părintele, AB2474 a fost de 1 ori mai sensibilă la PHMB și de 1 ori mai puțin sensibilă la acidul nalidixic (tabelul suplimentar 3, rândurile umbrite în gri deschis). Prin urmare, niciunul dintre mutanții cu răspuns SOS testați nu a prezentat modificări ale susceptibilității la PHMB care să indice implicarea unui răspuns SOS.

În cele din urmă, am analizat dacă alte căi de răspuns la stres (non-SOS) afectează susceptibilitatea la PHMB. Am testat o serie de mutanți cunoscuți ai răspunsului la stres al E. coli în paralel cu părintele lor pentru susceptibilitatea la PHMB. Niciunul dintre mutanți nu a prezentat modificări ale valorilor MIC care să sugereze o implicare funcțională a oricăreia dintre căile de răspuns la stres (tabelul suplimentar 3). Prin urmare, efectele antibacteriene ale PHMB apar independent de panoul de mecanisme de răspuns la stres testate.

PHMB condensează cromozomii bacterieni in vitro

Dacă PHMB condensează cromozomii bacterieni în interiorul celulelor, acest lucru ar putea avea loc prin efecte directe sau indirecte asupra ADN-ului. Am suspectat efecte directe, deoarece s-a demonstrat că PHMB se leagă de fragmente de ADN in vitro15. Am decis să examinăm proprietățile de legare la ADN ale PHMB folosind ADN cromozomal izolat de E. coli. Interacțiunile PHMB-ADN au fost mai întâi examinate folosind un test de deplasare a mobilității electroforetice (EMSA) și un test de excludere a colorantului. PHMB a fost amestecat cu ADN cromozomal izolat din E. coli K-12, iar amestecurile au fost fracționate în geluri de agaroză/TBE, urmate de colorarea ADN-ului cu bromură de etidiu. Amestecurile PHMB:ADN care au avut un raport greutate:greutate de ≥0.5 a prezentat o mobilitate electroforetică clar întârziată, după cum indică reținerea ADN-ului în gode (Fig. 4a). Rezultate similare au fost obținute pentru PHMB-FITC. Mobilitatea întârziată și retenția în godeuri este în concordanță cu interacțiunile stabile dintre PHMB și ADN. De asemenea, testele EMSA au indicat o fluorescență redusă a bromurii de etidiu în prezența PHMB sau PHMB-FITC, ceea ce sugerează că bromura de etidiu a fost împiedicată să se lege de ADN din cauza formării de complexe PHMB:ADN. Această observație a fost investigată în continuare cu ajutorul colorantului de legare a ADN-ului SYTOX®Green într-un test de excludere a colorantului. În absența PHMB, SYTOX®Green s-a legat de ADN izolat de E. coli, după cum indică o creștere mare a fluorescenței, în comparație cu adăugarea doar a colorantului. Cu toate acestea, adăugarea prealabilă de PHMB a redus fluorescența cu >80% (Fig. 4b). Prin urmare, PHMB formează complexe cu ADN-ul bacterian într-un mod care întârzie mobilitatea electroforetică și maschează accesul ADN-ului la liganzii ADN. Rezultatele fiecăruia dintre aceste experimente indică faptul că PHMB se leagă direct de ADN.

Figura 4
figura 4

Figura 4

Legăturarea PHMB la ADN cromozomal bacterian in vitro.

(a) PHMB sau PHMB-FITC a fost amestecat cu ADN cromozomal izolat din tulpina K-12 de E. coli și probele au fost analizate prin EMSA. Tiparele de mobilitate întârziată în gel indică legarea ADN-ului de către PHMB. (b) Excluderea mediată de PHMB a legării SYTOX®Green la ADN cromozomal izolat de E. coli, unde fluorescența redusă indică legarea ADN-ului de către PHMB. (c) Spectroscopia de dicroism circular a amestecurilor de PHMB și ADN cromozomal E. coli izolat. (d) Reprezentarea grafică a elipticității în funcție de raportul PHMB:ADN.

Pentru a afla mai multe despre modul în care legarea PHMB la ADN influențează structura ADN-ului chomosomal, am folosit metode biofizice și microscopie. Combinațiile de PHMB și ADN cromozomal izolat de E. coli au fost examinate prin spectroscopie de dicroism circular (CD). PHMB singur nu a prezentat un spectru CD caracteristic, în timp ce ADN-ul cromozomal izolat a prezentat un spectru tipic de ADN cu o elipticitate maximă pozitivă în jurul valorii de 260 nm, un cross over negativ la 252 nm și un jgheab negativ la aproximativ 245 nm. Acest lucru ne-a permis să evaluăm modificările în spectrul CD al ADN-ului în urma adăugării de PHMB. Amestecurile de PHMB și ADN au prezentat o elipticitate redusă la 260 nm, ceea ce indică modificări structurale ale ADN-ului la legarea PHMB (Fig. 4c,d). De asemenea, împrăștierea dinamică a luminii (DLS) a arătat că legarea PHMB la ADN are ca rezultat formarea de nanoparticule de aproximativ 50-60 nm, cu un indice de polidispersitate scăzut (Fig. suplimentară 4a). În cele din urmă, microscopia electronică de transmisie (TEM) și microscopia de fluorescență au indicat, de asemenea, că legarea PHMB la ADN are ca rezultat formarea de nanoparticule (Fig. Suplimentară 4b,c). Prin urmare, aceste rezultate confirmă rapoartele anterioare conform cărora PHMB se leagă de ADN26 și relevă faptul că PHMB se leagă de ADN cromozomal bacterian izolat și poate condensa cromozomii într-o populație de nanoparticule cu polidispersitate scăzută.

Efectele antibacteriene ale PHMB sunt suprimate de un ligand dsADN

Rezultatele noastre privind efectele PHMB asupra bacteriilor nu pot fi reconciliate cu modelul de întrerupere a membranei pentru mecanismul primar de acțiune antibacteriană al PHMB. Mai degrabă propunem un nou model, în care PHMB intră în bacterii și apoi condensează cromozomii, așa cum este ilustrat în Fig. 5a. Dacă este corect, noul model ar prezice, de asemenea, interacțiuni funcționale între PHMB și alți liganzi de ADN, iar această idee ne-a oferit o modalitate de a testa modelul. Pe scurt, dacă acest model ar fi corect, ar fi de așteptat ca liganzii de ADN cu greutate moleculară mică să suprime puterea antibacteriană a PHMB prin competiția pentru situsurile de legare a ADN-ului în cadrul cromozomilor. Pentru a testa această posibilitate, au fost utilizate combinații pe perechi de PHMB și Hoechst 33258 în testele de sensibilitate la creștere. Hoechst 33258 este un ligand de ADN care se leagă în mod preferențial de șanțul minor al secvențelor bogate în AT27 și este permeabil la celule, ceea ce îl face o alegere potrivită pentru acest experiment de concurență.

Figura 5
figura5

Model pentru mecanismul de acțiune antibacteriană a PHMB și suprimarea inhibării creșterii.

(a) Mecanismul de acțiune antibacteriană propus pentru PHMB. (b) Interacțiuni de inhibare a creșterii pe perechi între PHMB și Hoechst 33258 și liganzii de control negativ care nu se leagă de ADN (triclosan și trimetoprim) în diverse specii bacteriene. (c) Relația dintre conținutul AT al genomului bacterian și interacțiunile antibacteriene cu PHMB. Reprezentarea grafică a interacțiunilor de inhibare a creșterii și a conținutului AT al ADN-ului la diverse specii. Valorile de interacțiune sunt indicii de concentrație inhibitoare fracționată (FICI) între PHMB și Hoechst 33258 sau liganzi de control negativ care nu se leagă de ADN (trimetoprim și triclosan). (d) Inhibarea creșterii Bacillus megaterium de către PHMB și suprimarea prin combinații cu ligandul ADN Hoechst 33258 (linii albastre). A se vedea tabelul suplimentar 4 pentru lista de specii și valorile de inhibiție.

Interacțiunile medicamentoase au fost calculate ca valori ale indicelui concentrației inhibitoare fracționate (FICI) folosind un panel de specii bacteriene divergente. Valorile FICI pentru PHMB:Hoechst au fost semnificativ mai mari decât pentru PHMB combinat cu oricare dintre cele două antibacteriene cu ligand non-ADN (Fig. 5b). De asemenea, valorile FICI pentru combinațiile PHMB:Hoechst prezintă o corelație pozitivă cu conținutul AT al cromozomului (Fig. 5c). Cu alte cuvinte, efectele antimicrobiene ale PHMB depind de accesul la ADN în interiorul celulelor. La B. megaterium, efectele combinațiilor PHMB:Hoechst au fost izbitoare, unde inhibarea creșterii de către PHMB a fost suprimată folosind concentrații subinhibitorii de Hoeschst 33258 (Fig. 5d). Prin urmare, Hoechst 33258, ligandul ADN cu moleculă mică, a salvat bacteriile de concentrațiile inhibitoare de PHMB.

Aceste interacțiuni medicamentoase pe perechi arată că efectele antibacteriene ale PHMB se produc în principal prin direcționarea ADN-ului în bacterii. În concordanță cu profilul de modificare a permeabilității celulare observat pentru PHMB (Fig. 1b); rezultatele indică, de asemenea, o competiție între PHMB și un ligand ADN pentru situsurile de legare a ADN în interiorul celulelor. Prin urmare, rezultatele experimentelor separate care implică doi liganzi ADN cunoscuți sunt în concordanță cu noul nostru model pentru activitatea PHMB.

PHMB intră în celulele mamiferelor, dar este exclus din nuclee

Modelul predominant pentru activitatea PHMB susține că PHMB ucide bacteriile prin deteriorarea membranelor bacteriene, iar polimerul nu interacționează cu membranele celulelor mamiferelor (a se vedea mai sus). Cu toate acestea, având în vedere proprietățile neașteptate de pătrundere a PHMB în celulele bacteriene și observațiile noastre recente că PHMB pătrunde în macrofage28 și keratinocite29 cultivate, am decis să evaluăm direct capacitatea sa de a pătrunde într-un panel de celule de mamifere. PHMB-FITC a fost adăugat la mai multe linii celulare de mamifere și la fibroblaste primare, iar absorbția a fost evaluată prin microscopie cu fluorescență și citometrie de flux. Am observat o absorbție clară în toate tipurile de celule testate (Fig. 6a,b). De asemenea, aceste condiții nu au dus la întreruperea integrității membranei celulelor de mamifere (Fig. suplimentară 5a). O inspecție atentă a imaginilor microscopice arată că PHMB-FITC a fost conținut în vezicule și a fost exclus din nuclee (Fig. 6a). Dacă este adevărat că endosomii captează PHMB, atunci eliberarea în citoplasmă ar trebui să dezobișnuiască PHMB-FITC și să conducă la o creștere a fluorescenței. Acest lucru se datorează faptului că fluorescența FITC este stinsă la un pH scăzut, iar pH-ul endosomal târziu este <630, în timp ce pH-ul citoplasmatic este de 7,4. Am observat că adăugarea de clorochină, un agent osmolitic/buffering31 , a crescut fluorescența celulelor tratate cu PHMB-FITC (Fig. 6c), în concordanță cu captarea polimerului în endosomi. Prin urmare, PHMB intră eficient în celulele mamiferelor, dar este prins în endosomi, ceea ce pare să restricționeze intrarea în nuclee.

Figura 6
figura 6

Intrarea PHMB în celulele mamiferelor.

(a) Fibroblastele primare au fost tratate cu PHMB-FITC (3,5 μg/mL), contracolorate cu Hoechst 33258 și observate prin microscopie cu fluorescență. (b) Analiza prin citometrie în flux a unui panel de celule de mamifere tratate cu PHMB-FITC. Inserție: un exemplu reprezentativ de histogramă de citometrie în flux a populațiilor de celule HeLa netratate (populație purpurie) sau tratate cu PHMB-FITC (0,4 μg/mL) (populație verde). (c) Celulele HeLa au fost tratate cu PHMB-FITC (3,5 μg/mL) și clorochină (0-20 μM) timp de 2 ore. Efectele clorochinei asupra fluorescenței au fost măsurate prin citometrie în flux, folosind media geometrică a intensității fluorescenței (unități arbitrare (U.A.), scară logaritmică).

.

Articles

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.