Micronucleu
MN provin din fragmente cromozomiale sau cromozomi întregi care întârzie în anafază în timpul diviziunii nucleare și nu sunt incluși în nucleii principali.13,18,19 MN sunt corpuri extranucleare mici care iau naștere în celulele în diviziune din fragmente de cromozomi/cromatide acentrice sau cromozomi/cromatide întregi care rămân în urmă în anafază și nu sunt incluse în nucleele fiice în telofaza.20 La telofaza, se formează un înveliș nuclear în jurul cromozomilor și fragmentelor rămase în urmă, care apoi se dezarhivează și iau treptat morfologia unui nucleu de interfază, cu excepția faptului că sunt mai mici decât nucleele principale din celulă (de unde și termenul de „micronucleu”).19 MN care adăpostesc fragmente cromozomiale pot rezulta din ruperea directă a ADN-ului dublu catenar, conversia rupturilor monocatenare în rupturi bicatenare după replicarea celulară sau inhibarea sintezei ADN.20
MN se pot forma prin diferite căi: și anume, din fragmente cromozomiale sau cromatidice acentrice. O mică proporție de fragmente cromozomiale acentrice poate proveni pur și simplu din rupturi de ADN dublu-catenar nereparate. Alte mecanisme care ar putea duce la formarea MN din fragmente acentrice includ repararea prin excizie simultană a bazelor deteriorate (de exemplu, 8-oxo-deoxigozigozina) sau inadecvate încorporate în ADN (de exemplu, uracilul) care se află în apropierea și pe catene complementare opuse de ADN.21 Un alt mecanism care poate duce la formarea MN din cauza evenimentelor de pierdere a cromozomilor este hipometilarea citosinei în secvențele repetate centromerice și pericentromerice, cum ar fi repetițiile satelitare clasice din regiunile pericentromerice și repetițiile de ordin superior ale ADN-ului satelit în ADN-ul centromeric.21 Datorită rolului central al proteinelor kinetochore în angajarea cromozomilor cu fusul, este probabil ca mutațiile care duc la defecte în dinamica interacțiunii dintre kinetochore și microtubuli să poată cauza formarea MN din cauza pierderii cromozomilor în anafază. Alte variabile susceptibile de a crește MN din cauza pierderii cromozomilor sunt defectele de asamblare a fusului mitotic, defectele punctelor de control ale mitozei și amplificarea anormală a centrosomului.21
Soarta MN după formarea lor în celula micronucleată este slab înțeleasă. Soarta lor postmitotică include: (1) eliminarea celulei micronucleate ca o consecință a apoptozei; (2) expulzarea din celulă (atunci când se preconizează că ADN-ul din interiorul MN nu este funcțional sau capabil de replicare din cauza absenței componentelor citoplasmatice necesare); (3) reincorporarea în nucleul principal (atunci când cromozomul reincorporat poate fi imposibil de distins de cel din nucleul principal și ar putea relua activitatea biologică normală); și (4) reținerea în citoplasma celulei ca entitate extranucleară (atunci când MN poate finaliza una sau mai multe runde de replicare a ADN/cromozomului).20,22
Avantajul cheie al testului CBMN constă în capacitatea sa de a detecta atât evenimentele clastogene, cât și cele aneugenice, care conduc la aberații cromozomiale structurale și, respectiv, numerice.20 Clastogenii induc MN prin ruperea dublei helixuri de ADN, formând fragmente acentrice care sunt incapabile să adere la fibrele fusului și să se integreze în nucleele fiice, fiind astfel lăsate în afara în timpul mitozei. Același lucru se întâmplă și cu cromozomii întregi cu kinetocorele deteriorate; aceștia nu se pot atașa la microtubulii care trag cromatidele spre celulele fiice în timpul mitozei și, astfel, rămân în afara noilor nuclee. Această deteriorare ar putea fi generată de substanțe chimice care reacționează cu proteinele care formează kinetochores.23,24
Aneugenii sunt substanțe chimice care împiedică formarea aparatului fusiform în timpul mitozei. Acești agenți generează nu numai cromatide întregi care sunt lăsate în afara nucleelor, formând astfel MN, ci și formarea de celule multinucleate, în care fiecare nucleu ar conține un număr diferit de cromozomi. Acești agenți sunt, de asemenea, susceptibili de a induce o creștere a figurilor mitotice care se observă clar în aceleași lame. Cu testul CBMN este posibil să se facă distincția între MN provenite din cromozomi întregi și cele provenite din fragmente acentrice, precum și să se determine dacă are loc o segregare defectuoasă a cromozomilor între nuclei într-o celulă binucleată care ar putea să nu conțină MN, prin utilizarea sondelor centromerice.8,10,19
Sondele de ADN centromeric sunt utilizate pentru a distinge între MN provenite din orice eveniment de pierdere de cromozomi întregi și MN care conțin fragmente de cromozomi acentrici. Utilizarea sondelor ADN centromerice specifice cromozomului permite atât determinarea evenimentelor specifice de pierdere de cromozomi care au ca rezultat MN, cât și segregarea inegală a cromozomilor specifici între nucleele fiice, chiar și în absența formării de MN.21 Sondele pancentromerice ar trebui utilizate numai pentru a distinge între MN care provin din rupturi cromozomiale (centromerice negative) și pierderi cromozomiale (centromerice pozitive). Sondele centromerice specifice cromozomului trebuie utilizate numai pentru a măsura malsegregarea (datorată nondisjuncției sau pierderii de cromozomi) care implică cromozomi unici.8,10,19,21,25 Evaluarea originii mecaniciste a MN individuale prin identificarea centromerului și a kinetocorului contribuie la sensibilitatea și specificitatea ridicată a metodei.20
Factori importanți influențează frecvența MN de bază în limfocitele umane. Vârsta și sexul sunt cele mai importante variabile demografice care afectează indicele MN; frecvențele la femei sunt mai mari decât cele de la bărbați cu un factor de 1,2-1,6, în funcție de grupa de vârstă.26 Frecvența MN a fost corelată semnificativ și pozitiv cu vârsta la bărbați și femei și este afectată de factori alimentari, cum ar fi deficiența de folat și nivelurile plasmatice de vitamina B12 și homocisteină. S-a propus, de asemenea, că indicele MN poate fi influențat de propensiunea celulelor unui individ de a suferi apoptoză și de factori genetici, cum ar fi polimorfismele genetice.10,20,27
Într-o formă generală, formarea MN este atribuită unei varietăți de insulte asupra materialului genetic, care ar putea fi clasificate ca factori exogeni și endogeni. Factorii exogeni includ radiațiile, agenții chimici și invazia microorganismelor. Factorii endogeni includ defecte genetice, modificări patologice, deficiență de ingrediente nutriționale esențiale (de exemplu, acid folic) și leziuni induse de produse metabolice dăunătoare (cum ar fi speciile reactive de oxigen).28
Ipoteza unei asocieri predictive între frecvența MN în testul CBMN în limfocite și dezvoltarea cancerului este susținută de o serie de constatări: (1) o asociere între frecvența MN și riscul de cancer a fost dedusă din similitudinile mecaniciste cu aberațiile cromozomiale, care s-au dovedit a fi predictive pentru cancer; (2) in vitro, se observă o concordanță ridicată între aberațiile cromozomiale și MN; (3) se observă o creștere a frecvenței MN în limfocitele pacienților cu cancer și la pacienții cu sindroame care îi fac predispuși la cancer, cum ar fi sindromul Bloom și ataxia telangiectasia; (4) frecvența MN este asociată în mod semnificativ cu concentrația în sânge a unor vitamine, cum ar fi folatul, ale căror deficiențe sunt asociate cu un risc crescut pentru unele tipuri de cancer; (5) există o legătură directă între frecvența MN și stadiile timpurii ale carcinogenezei: și anume, o asociere semnificativă între frecvența crescută a MN și categoriile de diagnostic de grad scăzut și de grad înalt de carcinogeneză cervicală la femei.20
Formarea anomaliilor nucleare, cum ar fi MN, rearanjamentele cromozomiale și punțile de anafază (care duc la cicluri de rupere-fuziune-punte și la generarea mai multor MN) sunt evenimente frecvent întâlnite în stadiile timpurii ale carcinogenezei. Nivelurile ridicate de MN indică defecte de reparare a ADN-ului și de segregare a cromozomilor care ar putea duce la generarea de celule fiice cu un dozaj modificat al genelor sau la dereglarea expresiei genice care ar putea duce la evoluția fenotipului de instabilitate cromozomială observat adesea în cancer. Aceste considerații oferă un sprijin mecanicist pentru o posibilă asociere cauzală între frecvența MN și riscul de cancer. Un studiu realizat de Bonassi et al.29 a observat o asociere între frecvența MN și riscul de cancer în tumorile maligne non-hematologice, ceea ce sugerează că evenimentele de deteriorare a genomului în limfocite pot fi corelate cu evenimentele de inițiere a cancerului în alte țesuturi prin intermediul unui factor genetic, alimentar sau de mediu comun.
.