Microbiologie & Experimentări

În acest studiu a fost realizată izolarea și caracterizarea tulpinilor bacteriene din municipiul Barrackpore și din depozitul de deșeuri Dhapa. Creșterea bacteriilor depinde de diferite condiții fizico-chimice, cum ar fi mediul, pH-ul, temperatura, perioada de incubare, sursa de carbon etc. Prin urmare, ar trebui studiate diferitele condiții în care au crescut bacteriile în habitatul natural înainte de a trece la o multiplicare masivă pentru a le utiliza ca agenți de descompunere. Astfel, au fost luați în considerare următorii parametri:

Caracteristicile fizice și chimice ale deșeurilor municipale solide

Bacteriile se pot dezvolta într-o gamă largă de niveluri de umiditate. În acest studiu, s-a constatat că conținutul de umiditate al eșantionului colectat de la municipalitatea Barrackpore și de la groapa de gunoi Dhapa a fost de aproximativ 65,32% și, respectiv, 66,45%. Populația bacteriană a diferitelor soluri este strâns corelată cu conținutul lor de umiditate. Densitatea bacteriană maximă se găsește în regiunile cu un conținut de umiditate destul de ridicat, iar nivelul optim pentru activitățile bacteriilor aerobe este adesea de 50%-75% din capacitatea de reținere a umidității solului.1 În cele mai multe soluri aerobe se găsesc numere din genurile Pseudomonas, Achromobacter și Bacillus; acolo unde condițiile sunt anaerobe și umede, vor apărea Clostridium. Actinomicetele au prezentat o creștere cantitativă similară în astfel de condiții.15

În acest studiu, pH-ul celor două medii selectate (BCDA și NA) a fost optimizat pentru cultivarea tulpinilor bacteriene. Ph-ul probei colectate a fost de 7,79 în ambele probe. Ph-ul este un factor cheie pentru cultivarea bacteriilor în medii artificiale. Optimizarea pH-ului a fost realizată în două medii selectate, și anume Nutrient Agar (NA) și Basic czapek dox agar (BCDA). S-a constatat că NA și BCDA la pH 7,2 și 7,6 sunt potrivite pentru creșterea maximă a tulpinilor bacteriene. Din rezultate, s-a constatat că pH-ul probei a fost de aproximativ 7,79 și, posibil din acest motiv, s-a constatat că aceste tulpini se dezvoltă bine și în condiții in vitro la pH 7-8 în BCDA și NA. Bacteriile pot tolera o reacție a solului între nivelurile de pH 4 și 10, dar pH-ul cel mai favorabil pentru majoritatea este doar o parte alcalină spre neutralitate. Bacterii precum Thiobacillus thiooxidans și Acetobacter sp. sunt capabile să se dezvolte la valori foarte scăzute ale pH-ului, între 0 și 2, iar unele Bacillus sp. se pot dezvolta la un pH de 11.15 Creșterea optimă a Thermoactinomycetes are loc la pH 8 sau 9 și este foarte mult deprimată de reacții de aproximativ pH 516 Vibrio, Streptococcus faecalis și Escherichia coli tolerează, de asemenea, o reacție alcalină (pH 8-9). 16

Conținutul NPK al probei a fost studiat inițial. S-a constatat că conținutul de materie organică a fost de 27,84% (Municipiul Barrackpore) și 29,32% (Dhapa), conținutul de azot în % a fost de 0,165 (Municipiul Barrackpore) și 0,179 (Dhapa), conținutul de fosfor în % a fost de 0,502 (Municipiul Barrackpore) și 0,545 (Dhapa), iar conținutul de potasiu în % a fost de 18,29 (Municipiul Barrackpore) și 19,21 (Dhapa). Toate aceste analize au oferit o înțelegere clară a mediului nativ al bacteriilor și astfel au fost factorii determinanți în izolarea și cultivarea tulpinilor.

Caracteristicile culturale ale izolatelor bacteriene

În studiul nostru, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 și C3 -aceste 9 tulpini bacteriene au fost izolate în medii de cultură. Czapek dox agar și Nutrient agar au fost selectate pentru a determina mediile cele mai potrivite pentru a asigura o creștere masivă a tulpinilor izolate. czapek dox agar (BCDA) a fost potrivit pentru creșterea masivă a BM3, D1,C2 și mediul Nutrient agar (NA) a fost potrivit pentru creșterea masivă a BM1, BM2, D2, D3, D4, C3. S-a observat că mediul care conține extract de drojdie și xilan a fost potrivit pentru creșterea maximă a bacteriilor, dar Pseudomonas sp., Bacillus spp. și Aeromonas sp. se dezvoltă bine în mediul de agar nutritiv. Observarea vizuală și microscopică a fost utilizată pentru a caracteriza tulpinile selectate. Detaliile privind caracteristicile coloniilor de bacterii sunt notate (tabelul 1). Colorația Gram este o metodă veche și fiabilă de observare a bacteriilor. Bacteriile Gram negative au fost decolorate cu alcool, pierzând culoarea purpurie a cristalului violet. Bacteriile Gram pozitive nu s-au decolorat și au rămas purpurii.

În prezenta investigație, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 și C3 -aceste 9 tulpini bacteriene au fost izolate și s-a efectuat caracterizarea microbiologică. Rezultatele au arătat că BM1, BM3, D1 sunt bacili gram pozitivi, BM2 sunt bacili scurți gram pozitivi, D2 sunt diplobacili gram pozitivi, D3, C2 sunt bacili gram negativi, D4 sunt bacili scurți gram negativi și C3 este un cocos gram pozitiv. S-au efectuat, de asemenea, diferite teste biochimice pentru cele 9 izolate pentru a le cunoaște caracteristicile biochimice. Detaliile privind caracterele biochimice ale bacteriilor sunt notate în (tabelul 2).

Rezultatele de mai sus au dat o idee despre morfologia, caracteristicile coloniilor și natura biochimică a tulpinilor izolate, ceea ce ar ajuta în viitor la identificarea și caracterizarea tulpinilor bacteriene izolate.

Optimizarea condițiilor de creștere

În prezenta investigație, creșterea tulpinilor izolate a fost observată în diferite medii de creștere precum NA, ACDA și BCDA. S-a observat că mediul basic czapek dox agar (BCDA) a fost potrivit pentru creșterea masivă a BM3, D1, C2, iar mediul Nutrient agar (NA) a fost potrivit pentru creșterea masivă a BM1, BM2, D2, D3, D4, C3.

În acest experiment, culturile bacteriene a 9 tulpini au fost incubate la diferite temperaturi, cum ar fi 25, 29, 34, 37 și 40 °C. Creșterea optimă a tuturor tulpinilor a fost constatată la 37 °C. Intervalul optim de temperatură pentru bacterii este de aproximativ 25-36°C. Un număr mare de bacterii se pot dezvolta destul de bine la o temperatură de 10-4°C.6 Sultana17 a observat că temperatura de 33 ± 4°C este ideală pentru creșterea bacteriilor.17 Anumite bacterii se dezvoltă cel mai viguros la temperaturi sub 20°C. Bacteriile termofile se dezvoltă bine la temperaturi de 45-65°C, iar unele termofile sunt incapabile să se înmulțească la temperaturi mai mici de 40°C.1

Suferințele obținute în acest studiu au fost incubate pentru diferite perioade de incubare (6, 12, 24, 36, 48 și 72h). Perioada de incubare de 24h a fost potrivită pentru BM1, BM2, D2, D3, D4, C3, în timp ce BM3, D1 și C2 s-au dovedit a fi potrivite cu o perioadă de incubare de 36 h. Bacteriile coliforme se dezvoltă în perioada de incubare de 24±2h și la 32°C și prezintă o creștere bună la 37°C pentru 48 h de incubare. În urma observației vizuale, s-a constatat că, după 24 de ore de incubare, culoarea BM2 era portocaliu deschis, BM1 era albă, iar BM3 era alb-crem în mediul lor preferat (BCDA și NA). După 48-72 h de incubare, culoarea BM2 era portocalie, BM1, D1 era galbenă, C2 era roșie, iar BM3, D2, D3, D4, C3 au rămas alb-crem. Tipurile de colonii ale tulpinilor BM1, BM2, D2 și D4 au fost umede, iar restul au fost cremoase. Stafilococii și micrococi produc colonii maro auriu, galbene sau albe pe medii obișnuite. Unii Enterococi, Coryneformi și Enterobacterii pot produce colonii negre pe medii obișnuite.8

Dezvoltarea antagonismului

Metoda streaking încrucișat a fost utilizată pentru a determina antagonismul dintre tulpinile bacteriene în vederea aplicării lor viitoare în diferite aspecte. Detaliile antagonismului în cadrul izolatelor bacteriene sunt descrise (tabelul 3).

BM2 prezintă antagonism cu toate celelalte tulpini, astfel încât nu este posibil să se dezvolte un consorțiu folosind această tulpină ca unul dintre izolate. D1, D3 prezintă, de asemenea, antagonism cu majoritatea celorlalte tulpini. BM1 este cea mai puternică tulpină, deoarece nu are antagonism cu niciunul dintre celelalte izolate. BM3, D2, D4, D4, D5 și D6 au antagonism cu câteva izolate și aceste tulpini, împreună cu BM1, pot fi testate în diferite combinații pentru prepararea consorțiului.

Terapie de toleranță la metale grele

Cinci metale grele (As, Zn, Pb, Hg, Cd) au fost selectate pentru determinarea capacității de toleranță la metale a tulpinilor bacteriene izolate (BM1, BM2, BM3, DF1, D2, D3, D4, C2, C3). Testul de toleranță a indicat că, dintre cele cinci metale grele experimentate, toleranța maximă a fost demonstrată la Pb, înregistrându-se o creștere a microorganismelor până la 4000 ppm, iar toleranța minimă la Cd, care nu a înregistrat nicio creștere peste 30 ppm. MIC a fost observată atunci când izolatele nu au reușit să se dezvolte pe plăci chiar și după 10 zile de incubare. Rezultatul arată că, pentru toate cele trei bacterii, CMI a variat între 250 ppm și 350 ppm pentru As, Cd (10-30 ppm), Zn (200-300 ppm), Hg (200-300 ppm) și Pb (3000-4000 ppm) (tabelul 4). În studiul de față, cea mai mare toleranță la As și Cd a fost găsită în BM1, în timp ce cea mai mare toleranță la Zn este observată în BM2, iar BM3 a prezentat o acumulare maximă de Hg și Pb. În studiul nostru, cel mai toxic metal (cu cea mai mică CMI) este cd, în timp ce cel mai puțin toxic metal testat este Pb (tabelul 4).

MIC a fost observată atunci când izolatele nu au reușit să crească pe plăci nici după 10 zile de incubare.18 Mergeay et al.19 au testat concentrațiile minime inhibitorii (CMI) ale mai multor metale diferite și au constatat că metalul cel mai toxic (cu cea mai mică CMI) a fost mercurul, în timp ce metalul cel mai puțin toxic a fost manganul.19 Toleranța microbiană la fiecare concentrație de metal greu a fost descrisă prin testul cup assay. Diametrul zonei de inhibiție din jurul fiecărei cupe a crescut odată cu creșterea concentrației de metale grele, indicând efectul toxic al metalelor grele asupra creșterii microorganismelor. Municipalitatea din Barrackpore și depozitul de deșeuri Dhapa colectează toate deșeurile solide menajere și industriale din orașul Barrackpore, respectiv din orașul Kolkata și din zonele înconjurătoare. Deșeurile provenite din surse domestice și industriale reprezintă mediul adecvat în care microorganismele pot dezvolta rezistență la metalele grele. Prezența unei cantități mici de metale grele în deșeurile solide poate induce apariția unor microorganisme rezistente la metale grele. Rezistența microbiană la metale grele este atribuită unei varietăți de mecanisme de detoxifiere dezvoltate de microorganismele rezistente, cum ar fi complexarea prin exopolizaharide, legarea de învelișurile celulelor bacteriene, reducerea metalelor, efluxul de metale etc. Aceste mecanisme sunt uneori codificate în gene plasmidice care facilitează transferul rezistenței la metale toxice de la o celulă la alta.20 Organismele rezistente la metale grele ar putea fi un agent potențial de bioremediere a poluării cu metale grele. Având în vedere că toate metalele grele sunt similare în mecanismul lor toxic, toleranțele multiple la metale sunt fenomene comune în rândul bacteriilor rezistente la metale grele.21

Testul de sensibilitate la antibiotice

Testul de sensibilitate la antibiotice ajută la determinarea eficacității unui antibiotic împotriva organismului testat. Cele 9 izolate au fost analizate pentru determinarea sensibilității față de patru antibiotice, iar rezultatul este notat (tabelul 5). Compușii antimicrobieni sunt produși de majoritatea izolatelor care pot servi științei medicale. D1, D3 și D5 nu au prezentat activitate antimicrobiană.

Sesizarea activității antimicrobiene

Producerea de compuși antimicrobieni pare a fi un fenomen general pentru majoritatea bacteriilor. În studiul de față, 3 izolate au prezentat activitate antibacteriană și 5 izolate au prezentat activitate antifungică, dar 3 izolate nu au prezentat nici activitate antibacteriană, nici antifungică împotriva agenților patogeni. Rezultatul a fost reprezentat (tabelul 6). Un studiu similar a fost raportat de Subramaniam et al.22 O varietate de compuși antimicrobieni sunt produși de membrii genului Bacillus, mulți dintre aceștia fiind identificați ca peptide, lipopeptide și derivați fenolici. Căutarea de noi metaboliți secundari cu activitate biologică diversă în medii asortate a câștigat o atenție sporită în ultimii ani.

Producția de enzime extracelulare

Cu o conștientizare din ce în ce mai mare privind protecția mediului, utilizarea enzimelor, în special a celor provenite de la extremofile, a câștigat o atenție considerabilă în multe procese industriale. În ultimii ani, enzimele microbiene au înlocuit catalizatorii chimici în fabricarea produselor chimice, textile, farmaceutice, a hârtiei și a produselor chimice agricole alimentare. În prezent, bioprocesele industriale bazate pe enzime concurează direct cu procesele chimice consacrate. Cu toate acestea, în acest studiu, cele 9 izolate au fost supuse unui test calitativ pentru producția a opt enzime diferite, cum ar fi protează, lecitinază, DNază, lipază, cellază, amilază, catalază și oxidază. Un studiu similar a fost raportat de Subramani și Narayanasamy.23 În mod interesant, în studiul nostru, 6 dintre ei au prezentat producția de protează, enzimă care are o valoare de piață ridicată. Toate cele 9 tulpini au produs enzima catalază și oxidază. Rezultatul este notat (tabelul 7).

Testul proteazei

6 tulpini (BM1, BM3, D1, D1, D3, C2 și C3) dintre cele 9 izolate au prezentat o producție de protează. Proteaza având o aplicație larg răspândită în industria alimentară, industria detergenților, industria farmaceutică, precum și în degradarea deșeurilor solide, s-a efectuat o analiză cantitativă a proteazei produse. Activitatea enzimei protează astfel produsă a fost determinată, iar rezultatul a fost exprimat în UI/ml. Rezultatul este prezentat în tabelul 8. Testarea cantitativă a proteazei a dovedit invariabil că, dintre cele 6 tulpini, BM1 produce protează cu o valoare ridicată a titrului, iar Gupta et al.,24 au raportat în mod similar producția de protează alcalină din specii bacteriene și aplicarea sa industrială.

Potențialul de degradare a deșeurilor de către bacteriile izolate

Enzima protează are o aplicație vastă în degradarea deșeurilor. Astfel, cele 6 tulpini capabile să producă enzima protează au fost supuse unui test de eficiență a degradării deșeurilor. În studiul nostru se poate observa că BM1 are cel mai mare potențial de degradare, urmată de BM3. BM1 este, de asemenea, un producător puternic de enzimă proteazică și, prin urmare, are și o capacitate de degradare mai bună (figura 1). Pe măsură ce deșeurile sunt descompuse de microorganisme (bacterii), greutatea gunoiului scade. În prezentul studiu de descompunere, am observat că greutatea gunoiului tratat a scăzut deoarece bacteriile l-au descompus și l-au transformat în molecule simple. Procentul de pierdere a greutății eșantioanelor de deșeuri a crescut odată cu progresia procesului de descompunere, după cum se poate observa în figura 1. O observație similară a fost raportată de Zaved și colab. 25 privind studiul pierderii de greutate a gunoiului de către bacterii specifice în Bangladesh. În studiul nostru se poate observa că BM1 are cel mai mare potențial de degradare, urmat de. Astfel, BM1 poate fi utilizat în mod eficient pentru bioremedierea deșeurilor solide.