Introducere
Proteinele fluorescente (FP) au fost utilizate ca etichete proteice încă de la mijlocul anilor 1990, în principal pentru biologia celulară și microscopia de fluorescență. Aceste etichete nu numai că au revoluționat biologia celulară, permițând vizualizarea aproape a oricărei proteine, dar sunt utilizate și în aplicații biochimice. Un exemplu important este imunoprecipitarea și purificarea prin afinitate a proteinelor marcate cu FP, care a fost permisă de dezvoltarea de rășini de afinitate cu randament, puritate și afinitate ridicate, cum ar fi Nano-Traps de la ChromoTek (https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/).
În acest blog oferim o trecere în revistă a
- proteinelor fluorescente verzi
- proteinelor fluorescente roșii
- proteine cu auto-etichetare, care necesită cuplarea covalentă a unei molecule fluorescente
Tipuri de proteine fluorescente
Majoritatea cercetătorilor folosesc proteine fluorescente intrinseci GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP sau mCherry. Alternativ, au fost introduse proteine extrinsec fluorescente sau cu auto-etichetare care necesită cuplarea covalentă a unei molecule fluorescente cu proteina nefluorescentă, de exemplu, etichetele proteice SNAP, CLIP și Halo. Aceste proteine fluorescente cu auto-etichetare au anumite avantaje de performanță față de FP intrinseci datorită proprietăților coloranților lor fluorescenți.
Figura 1: Structuri ale proteinelor fluorescente.
(A) Proteinele fluorescente intrinseci (FP), cum ar fi EGFP, GFP, RFP, mNeonGreen, turboGFP etc. au doar un număr mic de reziduuri comune, dar se pliază toate într-o structură conservată de tip β-barrel. Fluorescența lor apare prin ciclicizarea și oxidarea coloanei vertebrale a trei reziduuri de aminoacizi din centrul acestui butoi (evidențiate în dreapta), ceea ce are ca rezultat un cromofor cu două inele. Acest proces chimic este descris ca fiind maturizarea cromoforului, este inerent pliului proteic și depinde doar de variabilele de mediu, cum ar fi temperatura și concentrația de oxigen, dar nu și de enzime suplimentare. Culoarea, fotostabilitatea, randamentul cuantic și alte proprietăți spectrale ale proteinelor intrinsec fluorescente sunt rezultatul unor mutații în cadrul aminoacizilor care alcătuiesc cromoforul sau care sunt localizați în vecinătatea cromoforului.
(B) Proteinele extrinsec fluorescente, cum ar fi HaloTag, nu sunt fluorescente în forma lor apo bazală. Numai dacă un fluorofor activat adecvat este adăugat la proteina HaloTag, acest fluorofor va fi capturat și legat covalent de reziduul D106 al HaloTag, transformând HaloTag în fluorescentă. (ID-uri PDB pentru structuri: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)
Proteina fluorescentă verde de meduză (GFP) și derivații săi sunt încă cele mai frecvent utilizate proteine fluorescente în cercetarea biomedicală. Recent, au fost introduse proteine fluorescente verzi suplimentare care sunt derivate din alte organisme. Aceste FP dețin același pliu de bază ca și GFP, dar prezintă mari divergențe la nivel de secvență. Prin urmare, ele necesită instrumente de cercetare noi, dedicate, cum ar fi anticorpii.
Originalul: GFP
Proteina fluorescentă verde a fost izolată pentru prima dată din meduza Aequorea victoria în 1962 de Osamu Shimomura. Ea are o fluorescență verde cu deplasare Stokes lungă (ex 395 nm; em 509 nm). 30 de ani mai târziu, Douglas Prasher a reușit în cele din urmă să cloneze secvența de GFP, iar Martin Chalfie a exprimat această secvență in vivo. Mai târziu, laboratorul lui Roger Tsien a dezvoltat GFP într-o suită de instrumente de cercetare veritabile. Shimomura, Chalfie și Tsien au primit Premiul Nobel în 2008. Vedeți prelegerea lui Roger Tsien la Premiul Nobel aici: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.
Cercetătorii au dezvoltat o multitudine de variante de GFP cu proprietăți diferite. Aceste FP-uri au proprietăți funcționale și spectrale diferite. Prima îmbunătățire semnificativă a GFP a fost o mutație (S65T) care a crescut intensitatea și stabilitatea semnalului de fluorescență. Principalul vârf de excitație a fost deplasat la 488 nm (Heim et al., 1995). Varianta comună EGFP este o versiune modificată a GFP, care facilitează utilizarea practică a GFP într-o varietate de organisme și celule diferite.
Proteina fluorescentă verde GFP este cunoscută și sub numele de avGFP, wtGFP și gfp10; EGFP ca GFP îmbunătățită și GFPmut1.
https://www.fpbase.org/protein/avgfp/
https://www.fpbase.org/protein/egfp/
TurboGFP
Denunțată în 2004, TurboGFP este o proteină fluorescentă verde dimerică, luminoasă și cu maturitate rapidă, derivată din CopGFP de la copepodul Pontellina plumata. Copepod TurboGFP este îndepărtată din punct de vedere evolutiv de proteinele fluorescente derivate din meduze, cum ar fi EGFP, și împarte doar aproximativ 20% din identitatea de secvență cu variantele GFP utilizate în mod obișnuit. Prin urmare, majoritatea anticorpilor anti-GFP, inclusiv GFP-Nanobody utilizat în GFP-Trap, nu se leagă de TurboGFP.
https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/
mNeonGreen
mNeonGreen este derivat dintr-o proteină galbenă fluorescentă multimerică a lanceolei Branchiostoma lanceolatum. Prin urmare, mNeonGreen este îndepărtată din punct de vedere evolutiv de FP derivate din meduze. mNeonGreen și derivații obișnuiți ai GFP au doar aproximativ 20% de identitate de secvență. Datorită similitudinii reduse a secvenței, este de așteptat ca instrumentele de afinitate (de exemplu, anticorpii) pentru variantele GFP să nu se lege de mNeonGreen. Cu siguranță, acest lucru a fost demonstrat în cazul reactivilor de afinitate ChromoTek (Nanobodies/ VHH-uri și anticorpi anti-GFP).
Primul publicat în 2013, mNeonGreen este de până la trei ori mai strălucitor decât GFP. Este o proteină fluorescentă verde/galbenă monomerică versatilă, emergentă, pentru aplicații de imagistică, inclusiv pentru microscopia de super-rezoluție. În plus, mNeonGreen acționează ca acceptor pentru proteinele fluorescente cian în aplicațiile de transfer de energie prin rezonanță de fluorescență (FRET). Se pare că este cea mai luminoasă proteină fluorescentă verde monomerică cunoscută până în prezent și are o rată de maturare rapidă.
https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/
Comparație între GFP, TurboGFP, și mNeonGreen
Proprietatea |
EGFP (cel mai frecvent utilizat derivat GFP) |
turboGFP |
mNeonGreen |
|---|---|---|---|
|
Descoperire/ prima publicare |
|||
|
Origine |
GFP de la meduza |
CopGFP de la copepodul Pontellina plumata |
proteina galbenă fluorescentă multitimerică din lanceola Branchiostoma lanceolatum |
|
Rapiditatea de maturare (la 37°C) |
25 min |
25 min |
10 min |
|
Identitate de secvență cu EGFP |
(100%) |
~20% |
~20% |
|
Derivat din GFP? |
Nu |
Nu |
|
|
Structura |
Slabă dimer |
Dimer |
Monomer |
|
Variante comune |
AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, eGFP monomerică eGFP A206K, CFP, eCFP, mCerulean, YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet, BFP |
TurboGFP, CopGFP |
mNeonGreen |
|
Maximul de excitație/emisie |
488 nm/ 509 nm |
482 nm/ 502 nm |
506 nm/ 517 nm |
|
Lungime/ greutate moleculară (MW) |
239 aminoacizi, |
2x 232 aminoacizi, |
237 aminoacizi, |
|
Instrumente de cercetare oferite de ChromoTek |
Imunoprecipitare: GFP-Trap Western blot: Anticorp anti-GFP de șobolan Control: proteină EGFP purificată |
Imunoprecipitare: TurboGFP-Trap |
Imunoprecipitare: mNeonGreen-Trap Western blot: Anticorp anti-mNeonGreen de șoarece |
Proteinele fluorescente roșii (RFP) sunt FP-uri care emit lumină fluorescentă roșu-portocaliu. Prima RFP care a devenit disponibilă în comerț a fost DsRed. Aceasta a fost derivată din anemonele de mare Discosoma sp. în 1999.
DsRed are unele probleme practice imanente: (i) Are un timp de maturare de aproximativ 24 de ore, ceea ce îl face inutilizabil pentru experimentele de timp scurt(er). (ii) Forma tetramerică a DsRed poate compromite funcția proteinelor la care este atașat. (iii) Fotostabilitatea sa este destul de scăzută.
În consecință, DsRed a fost supus mutagenezei dirijate pe site pentru a deveni aplicabil în mod obișnuit ca o etichetă de fuziune codificată genetic. În cele din urmă, au fost creați derivați monomerici RFP cu performanțe fluorescente mai bune (în ceea ce privește luminozitatea și fotostabilitatea) și cu o eficiență de maturare mai mare. În plus, au fost generați derivați cu fluorescență portocalie, roșie și roșu îndepărtat. Aceste versiuni monomerizate ale RFP au devenit valoroasele instrumente de cercetare mCherry, mOrange, mRaspberry, mPlum (cunoscute și sub numele de „mFruits”), mKO, mRFP (a.k.a. mRFP1), mRFPruby, mRuby, mRuby, tagRFP, mKate2 și DsRed-Express etc.
PRF-uri suplimentare au fost identificate și la alte antozoare (de exemplu, anemone și corali), dar și aceste proteine erau în mare parte tetrameri. Astfel, ele nu au fost încă optimizate în continuare pentru a fi utilizate în cercetare.
mRFP (cunoscută și sub numele de mRFP1)
Prima variantă monomerică a dsRed, obținută prin inginerie genetică în laboratorul lui Roger Tsien, a fost denumită simplu mRFP (sau mRFP1), adică proteină fluorescentă roșie monomerică. Comparativ cu dsRed, mRFP1 se caracterizează prin niveluri ușor mai scăzute de absorbție, randament cuantic și fotostabilitate. Cu toate acestea, rata sa de maturare este de aproximativ 10 ori mai rapidă decât cea a DsRed, ceea ce duce la o luminozitate efectivă similară atunci când este exprimată în celule vii.
https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/
mCherry
mCherry este probabil cea mai frecvent utilizată variantă RFP. Este o proteină fluorescentă roșie monomerică cu aplicabilitate largă ca proteină de fuziune în diferite tipuri de celule. Ca și alte RFP mFruit, mCherry este derivată din varianta dsRed mRFP1 prin evoluție dirijată de către laboratorul lui Roger Tsien. În comparație cu alte mFruits, mCherry are cea mai mare fotostabilitate, cea mai rapidă rată de maturare și o rezistență excelentă la pH. Cu toate acestea, are un randament cuantic mai mic decât mRFP1.
https://www.fpbase.org/protein/mcherry/
mPlum
Laboratorul lui Roger Tsien a generat, de asemenea, un derivat monomeric roșu îndepărtat al mRFP1/dsRed, denumit mPlum. FP-urile de culoare roșie îndepărtată sunt benefice pentru aplicațiile de imagistică a întregului corp, deoarece principalii absorbanți tisulari, cum ar fi apa, lipidele și hemoglobina, sunt aproape transparenți în intervalul de emisie de 650-900 nm. La fel ca majoritatea RFP-urilor cu deplasare spre roșu, mPlum prezintă o deplasare Stokes extinsă.
https://www.fpbase.org/protein/mplum/
Comparare între mCherry, mRFP (mRFP1), și mPlum
| Proprietate | mCherry | mRFP (mRFP1) | mPlum | |
|---|---|---|---|---|
|
Descoperire/ prima publicare |
||||
|
Origine |
DsRed de la anemona de mare |
DsRed de la anemona de mare |
DsRed de la anemona de mare |
|
|
Rată de maturare (la 37°C) |
15 min |
60 min |
100 min |
|
|
Structura |
Monitor |
Monitor |
Monitor |
|
|
Agregare |
||||
|
Agregare |
nu |
nu |
||
|
Maximul de excitare/emisie |
587 nm/ 610 nm |
587 nm/ 610 nm |
584 nm/ 607 nm |
590 nm/ 649 nm |
|
Lungime/ greutate moleculară (MW) |
236 aminoacizi, |
228 aminoacizi, |
229 aminoacizi, |
|
|
Instrumente de cercetare furnizate de ChromoTek |
Imunoprecipitare: RFP-Trap |
Imunoprecipitare: RFP-Trap |
Imunoprecipitare: RFP-Trap |
Proteinele fluorescente extrinsecă Halo, SNAP și CLIP necesită captarea covalentă a unui mic ligand fluorescent pentru a se transforma într-o proteină fluorescentă. În acest scop, aceste etichete proteice cu auto-etichetare sunt derivate din enzime care catalizează formarea de legături chimice: Etichetele SNAP și CLIP sunt variante ale alchiltransferazei O6-alchilguanină-ADN care reacționează cu derivați de benzilguanină și, respectiv, benzilcitozină. HaloTag-ul este derivat dintr-o haloalcan dehalogenaza și reacționează cu alchilhalidele (figura 1).
În general, atât proteinele fluorescente intrinsec cât și extrinsec sunt fuzionate cu o proteină de interes pentru a permite vizualizarea și detectarea celulară a acesteia. Cu toate acestea, proteinele cu fluorescență extrinsecă necesită adăugarea unui fluorofor reactiv, care are mai multe avantaje:
- Reducție cuantică și fotostabilitate mai mari
- Fluorescență puternică atât în celule vii, cât și în celule fixate
- O selecție mai largă de coloranți fluorescenți
- O singură construcție genetică permite alegerea unor fluorofori distincți pentru multicoloritate. imagistică/multiplexare
Fluorescența este inițiată numai după adăugarea markerului
Disponibilitatea a trei proteine fluorescente extrinsecă cu specificități diferite de substrat/ligand permite utilizarea lor ortogonală în experimentele multiplexate, de asemenea, în combinație cu FP intrinseci.
În funcție de necesitățile experimentale, se pot utiliza liganzi permeabili la celule pe bază de tetrametilrhodamină (TMR), Oregon Green, diAcFAM sau cumarină, care traversează cu ușurință membrana celulară pentru marcarea proteinelor intracelulare. Alternativ, se pot aplica liganzi impermeabili la celule pe bază de fluorofori impermeabili, cum ar fi Alexa Fluor® 488 și 660, pentru marcarea rapidă a suprafeței celulare.
Compararea HaloTag, SNAP-Tag, și CLIP-Tag
| Proprietate | HaloTag | SNAP-Tag | CLIP-Tag |
|---|---|---|---|
|
Descoperire/prima publicare |
|||
|
Origine |
Haloalcan dehalogenaza de la Rhodococcus rhodochrous |
O6- uman.alchilguanină-ADN-alchiltransferază |
O6-alchilguanină-ADN- uman O6-alchilguanină-ADN-alkyltransferaza |
|
Structura |
Monomer |
Monomer |
Monomer |
|
Reactivitate |
Derivați de cloroalcan |
O6-.derivați de benzilguanină |
Derivați de benzilcitozină |
|
Liganzi |
Coloranți permeabili sau nepermeabili la celule, fluorofori, biotină și margele |
Coloranți permeabili sau nepermeabili la celule, fluorofori, biotină și margele |
Coloranți permeabili sau nepermeabili la celule, fluorofori, biotină, și margele |
|
Maximul de excitație/emisie |
Depinde de fluoroforul cuplat |
Depinde de fluoroforul cuplat fluorofor |
Depinde de fluoroforul cuplat |
|
Lungime/ greutate moleculară (MW) |
297 aminoacizi, |
182 aminoacizi, |
182 aminoacizi, |
|
Instrumente de cercetare oferite de ChromoTek |
Imunoprecipitare: Halo-Trap |
Imunoprecipitare: SNAP/CLIP-tag-Trap |
Imunoprecipitare: SNAP/CLIP-tag-Trap |
HaloTag
HaloTag-ul cu auto-etichetare a fost derivat din enzima haloalcan dehalogenaza DhaA din Rhodococcus rhodochrous. Situl său activ a fost modificat genetic pentru a se lega ireversibil de substraturile de legare a cloroalcanilor. Datorită acestui tip de inhibiție sinucigașă, nu mai este posibilă regenerarea situsului său catalitic pentru o dehalogenare ulterioară. În funcție de substratul ales, HaloTag-ul se transformă într-o etichetă proteică fluorescentă sau poate fi imobilizat pe perle de agaroză, de exemplu.
Deoarece haloalcan dehalogenazele sunt absente în celulele eucariote și în majoritatea procariotelor, inclusiv în E. coli, nu va exista o etichetare de fond.
SNAP-tag
Eticheta proteică de autoetichetare SNAP-tag este derivată din O6-alchilguanin-ADN-alchiltransferaza umană (hATG), care, ca proteină de tip sălbatic, elimină deteriorarea prin alchilare a ADN-ului. Varianta hAGT rezultată, utilizată ca SNAP-tag, reacționează covalent cu derivați de O6-benzilguanină (adică o etichetă fluorescentă conjugată cu grupele de plecare guanină sau cloropirimidină prin intermediul unui linker benzilic) într-un mod ireversibil și foarte specific. În reacția de marcare, gruparea benzil substituită a substratului este atașată covalent la SNAP-tag.
CLIP-tag
CLIP-tag este o versiune modificată a SNAP-tag, proiectată pentru a reacționa cu benzilcitozină mai degrabă decât cu derivați de benzilguanină. Atunci când este utilizat împreună cu SNAP-tag, CLIP-tag permite marcarea ortogonală și complementară a două proteine simultan în aceeași celulă.
Un ghid pentru alegerea proteinelor fluorescente
Shaner N.C., Steinbach P.A. și Tsien R.Y. (2005)
Nature Methods 2(12), 905-909 doi: 10.1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf
Proteine fluorescente verzi:
Proteina fluorescentă verde
Tsien R.Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.509.
Fluorescență verde îmbunătățită
Heim, R., Cubitt A.B. și Tsien R.Y. (1995)
Nature, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0
Baza structurală pentru maturizarea rapidă a proteinei fluorescente verzi Arthropoda
Evdokimov A.G., Pokross M.E., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A și Chudakov D.M. (2006)
EMBO reports, 7(10), 1006-1012. doi: 10.1038/sj.embor.7400787.
A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J. Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M, Davidson M.W. și Wang J. (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409. doi: 10.1038/nmeth.2413
Proteine fluorescente roșii:
Proteine fluorescente roșii, portocalii și galbene monomerice îmbunătățite derivate din proteina fluorescentă roșie Discosoma sp.
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E. și Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037
O proteină fluorescentă roșie monomerică
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. și Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699
Evoluția de noi proteine non-anticorp prin hipermutație somatică iterativă
Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. și Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.
Recuperarea deficienței de maturizare a cromoforului proteinei fluorescente roșii prin proiectare rațională
Moore M.M., Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. și Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463. doi: 10.1371/journal.pone.0052463.
Halo, SNAP, and CLIP:
Releasable SNAP-tag Probes for Studying Endocytosis and Recycling
Cole N.B. and Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.1021/cb2004252
Site-Specific Protein Labeling with SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Current protocols in protein science / editorial board, Coligan J.E. et al, 73: 30.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73
An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells
Gautier A., Juillerat A., Heinis C., Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. și Johnsson K. (2008)
Chemistry and Biology 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007
HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R, Friedman-Ohana R, Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. și Wood K.V. (2008)
ACS Chem. Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k
O metodă generală pentru marcarea covalentă a proteinelor de fuziune cu molecule mici in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. și Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.1038/nbt765
Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging
Provost C.R. and Sun L. (2010)
Visualized Exp. 39: 1876, doi: 10.3791/1876
Pentru utilizare exclusivă în scopuri de cercetare.
Produsele și tehnologia ChromoTek sunt acoperite de brevete acordate și de aplicații în curs de acordare deținute de ChromoTek GmbH sau disponibile pentru ChromoTek GmbH prin licență exclusivă.
ChromoTek, Chromobody, F2H, GFP-Trap, Myc-Trap, RFP-Trap, Spot-Tag, Spot-Label și Spot-Trap sunt mărci înregistrate ale ChromoTek GmbH. SNAP-tag este o marcă comercială înregistrată, iar CLIP-tag este o marcă comercială a New England Biolabs, Inc. Nanobody este o marcă comercială înregistrată a Ablynx, o companie Sanofi. Produsele altor furnizori pot fi mărci comerciale sau mărci comerciale înregistrate ale furnizorului corespunzător fiecare. Declarațiile cu privire la produsele altor furnizori sunt date în conformitate cu cele mai bune cunoștințe ale noastre.
.