Elevated 1-α Hydroxylase Activity in Monocytes from Patients with Active Tuberculosis

Abstract

Un pacient uremic a dezvoltat hipercalcemie după infecția cu tuberculoză, iar nivelurile sale de calciu ionizat s-au corelat cu nivelurile de 1,25-dihidroxivitamină D3 (1,25(OH)2D3). Am efectuat studii suplimentare pentru a determina dacă monocitele sunt situsuri alternative de conversie a 1,25(OH)2D3 dincolo de celulele tubulare renale. Folosind un biotest ex vivo, în acest studiu, am constatat că activitatea 1-α hidroxilazei (CYP27B1) în monocite este semnificativ mai mare la pacienții cu tuberculoză (TB) activă decât la cei cu contact frecvent cu TB. Cu toate acestea, atunci când monocitele de la pacienții cu TB activă au fost restimulate cu antigen derivat din Mycobacterium tuberculosis, s-a observat o cantitate mai mică de 1,25(OH)2D3. În schimb, nivelul de 1,25(OH)2D3 a rămas neschimbat la cei cu contact frecvent cu TB. Concluzionăm că monocitele pot fi o sursă alternativă de 1-α hidroxilază care ar putea transforma 25-hidroxivitamina D3 în 1,25(OH)2D3, mai activă.

1. Introducere

Tuberculoza a afectat lumea încă din timpuri preistorice. Potrivit unui raport recent, un milion de pacienți cedează anual din cauza tuberculozei și a comorbidităților asociate . În ultimele decenii, s-au depus eforturi uriașe pentru a înțelege procesul fiziopatologic al bolii. Modelele animale și studiile la om au deschis calea pentru clarificarea răspunsurilor imune individuale la Mycobacterium tuberculosis (MTB) . Aceste studii oferă dovezi că vitamina D joacă un rol important în rezistența umană la tuberculoză. vitamina D a fost utilizată pentru a combate tuberculoza de peste 200 de ani. Uleiul din ficat de cod și calciferolul, surse majore de vitamina D, au fost folosite încă din secolul al XVII-lea pentru a trata pacienții cu tuberculoză . În fiziologia normală, după expunerea la soare, 7-dehidrocolesterolul stocat în piele a fost transformat în previtamina D3 urmată de izomerizarea termică în vitamina D3 . Apoi, vitamina D3 este hidroxilată în ficat în 25-hidroxivitamina D3 (25(OH)D3). Apoi, 25(OH)D3 este în continuare hidroxilată în cea mai activă formă de vitamina D3, 1,25(OH)2D3, de către 1- hidroxilază (CYP27B1) . Celulele epiteliale tubulare renale sunt o sursă majoră de 1-hidroxilază și joacă un rol esențial în determinarea concentrației de 1,25(OH)2D3 în ser . Prezența CYP27B1 în țesuturile extrarenale a fost recunoscută de zeci de ani . Impactul CYP27B1 extrarenale asupra concentrației serice de 1,25(OH)2D3 nu a fost încă determinat.

Ne-am întâlnit cu un pacient de 34 de ani cu uremie, care a făcut hemodializă regulată timp de 2 ani. Pacientul a prezentat slăbiciune musculară cu oboseală timp de 2 zile înainte de a vizita un medic de familie. Chimia sângelui a evidențiat niveluri ridicate de calciu ionizat (5,44 mg/dL). În ciuda hipercalcemiei, simptomele pacientului au fost ameliorate prin tratament convențional. Patru luni mai târziu, pacientul a prezentat o slăbiciune musculară progresivă însoțită de febră. La Urgențe, s-au constatat din nou niveluri ridicate de calciu ionizat (6,88 mg/dL). În plus, un EKG a evidențiat un ritm cardiac anormal și un interval QT scurt cu o undă T lărgită. O radiografie toracică a arătat o infiltrație pulmonară în lobul superior drept, care a fost ulterior determinată ca fiind tuberculoză pulmonară. Pacientul a primit apoi 9 luni de tratament antituberculos. La patru luni după tratament, nivelul calciului ionizat al pacientului s-a normalizat (5,2 mg/dL), cu o rezolvare completă a simptomelor. Pentru a elucida patogeneza hipercalcemiei acestui pacient, am măsurat nivelurile de 1,25(OH)2D3 în plus față de nivelurile de calciu ionizat. După cum se arată în figura 1, nivelurile de 1,25(OH)2D3 au fost puternic corelate cu cele ale calciului ionizat.

Figura 1

Schimbări ale concentrațiilor de calciu ionizat și 1,25(OH)2D3 în serul unui pacient cu TB activă și uremie.

În plus față de expresia renală a CYP27B1, macrofagele și monocitele sunt considerate situsuri extrarenale importante ale expresiei CYP27B1. În acest studiu, am evaluat rolul monocitelor în metabolismul vitaminei D3 utilizând un biotest ex vivo. Mai mult decât atât, am stimulat monocitele cu antigen derivat din MTB pentru a obține o mai bună înțelegere a modului în care monocitele modulează metabolismul vitaminei D3 ca răspuns la provocarea bacteriană.

2. Materiale și metode

2.1. Populația de subiecți

Acest studiu a fost efectuat la Universitatea de Medicină din Kaohsiung. Participanții au fost stratificați în două grupuri: (1) TB activă și (2) contact frecvent cu TB. Cei cu tuberculoză pulmonară activă confirmată printr-o cultură de spută și o radiografie toracică au fost repartizați în grupul TB activă (). Contactele frecvente de TB () au inclus următoarele: (1) personalul medical care a lucrat la centrul TB timp de cel puțin 10 ani și care nu fusese niciodată infectat și (2) membrii familiei pacienților cu TB, clinicienii și asistentele care au avut contacte pe termen lung cu pacienții cu TB și care nu fuseseră niciodată infectați. Toate contactele frecvente cu TB au fost vaccinate cu BCG și au fost supuse anual unei radiografii toracice; atunci când radiografiile toracice au fost anormale, s-a efectuat un test Mantoux. Am exclus subiecții cu diabet, tumori maligne sau orice altă boală care ar putea cauza imunodeficiență. Cele două grupuri au fost potrivite ca sex și vârstă (tabelul 1).

2.2. Pregătirea celulelor

Celele mononucleare din sângele periferic (PBMC) au fost izolate din sângele tratat cu heparină recoltat de la cele 2 grupuri de donatori, utilizând un gradient standard Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suedia). PBMC ( celule/mL) au fost resuspendate în mediu RPMI 1640 suplimentat cu L-glutamină și 10% ser fetal de vițel. După incubarea timp de 1 oră într-un balon de 75 cm2 într-un incubator umidificat la 37°C, 5% CO2, mediul care conținea celule neaderente a fost decantat într-un tub conic, iar balonul a fost spălat de două ori cu mediu fără ser pentru a elimina orice celule neaderente reziduale. Monocitele aderente au fost îndepărtate prin răzuire ușoară cu o racletă celulară din plastic. Celulele au fost transferate într-un tub conic, centrifugate pentru a elimina soluția de spălare și resuspendate la celule/mL în mediu suplimentat. Populația de celule aderente conținea mai mult de 85 % celule CD14+.

2.3. Antigenul

MTB izolat de la pacienți cu tuberculoză a fost resuspendat în soluție salină tamponată cu fosfat și a fost ucis termic într-o baie de apă la 70°C timp de 70 de minute. Bacteriile au fost apoi sonicate cu ajutorul unui sonicator New Highway (Farmingdale, NY, SUA). Concentrația de proteine din omogenatul bacterian a fost determinată cu ajutorul kitului de analiză a proteinelor Pierce BCA (IL, SUA) și a fost depozitată la -20°C.

2.4. Analiza citofluorometrică

Analiza citometrică a fost efectuată cu ajutorul unui citometru FACS (Becton Dickinson). Un total de celule au fost incubate cu fiecare anticorp monoclonal în cantități saturate în 50 μL de tampon de colorare (soluție salină echilibrată Hank: 1% BSA și 0,1% azidă de sodiu) timp de 1 oră la temperatura camerei și apoi au fost spălate de trei ori cu PBS. Celulele au fost pregătite pentru analiză prin suspendare în 500 μL de paraformaldehidă 1% în PBS. Populația de monocite a fost selectată pentru analiză pe baza unei diagrame de puncte de împrăștiere laterală și de împrăștiere înainte. Un total de 5 000 de celule selectate au fost utilizate pentru fiecare analiză. Celulele grupate au fost analizate în continuare prin colorare fluorescentă utilizând anti-CD14 conjugat cu fluoresceină-izotiocianat (FITC-) (Ancell).

2.5. Cuantificarea 1,25(OH)2D3

Monocitele purificate au fost cultivate la o densitate de celule/mL în 100 μL în fiecare puț al unei plăci de cultură tisulară cu 96 de puțuri cu 200 nM de 25(OH)D3 dizolvată într-o concentrație finală de 1% etanol. După 3 ore de incubare, s-a adăugat 1 ml de acetonitril pentru a opri reacția. Celulele și mediul au fost recoltate și combinate cu un volum egal de metanol pentru a elimina lipidele. Cantitatea de 1,25(OH)2D3 a fost determinată cu ajutorul kitului 1,25-dihidroxivitamina D 125I RIA (INCSTAR, Stillwater, MN, SUA). Pe scurt, 2 ml de apă și 5 ml de metanol/apă (70 : 30) au fost adăugate la un cartuș C18OH pentru a elimina sărurile, lipidele polare și pigmenții în vid. Apoi, 5 ml de hexan/clorură de metilenă (90 : 10) au fost adăugate la cartușul C18OH pentru a elimina 25(OH)D3 și 5 ml de hexan/isopropanol (99 : 1) au fost adăugate pentru a elimina 24,25(OH)2D3/25,25(OH)2D3. Fiecare cartuș C18OH a fost montat strâns în interiorul unui cartuș de silice. După ce s-a adăugat hexan/isopropanol (92 : 8) sub vid, cartușul C18OH a fost îndepărtat. În cele din urmă, 1,25(OH)2D3 purificat a fost eluat din cartușul de silice în 5 ml de hexan/isopropanol (80 : 20). Nivelurile de 1,25(OH)2D3 au fost cuantificate prin radioimunoanaliză competitivă (RIA) utilizând anticorpi anti-1,25(OH)2D3 și anti-1,25(OH)2D3 marcați cu 125I.

2.6. Tratamentul cu antigene de MTB

Monocitele ( celule/mL) au fost incubate cu 10 μg/mL MTB și 200 ng/mL 25(OH)D3. După 3 ore de incubație, s-a adăugat 1 ml de acetonitril pentru a opri reacția. 1,25(OH)2D3 rezultată a fost purificată din celule și din mediu și a fost cuantificată prin RIA. Restul procedurii a fost aceeași ca și pentru testul anterior.

2.7. Analiză statistică

Toate datele au fost analizate cu ajutorul testului – Student.

3. Rezultate

3.1. Concentrațiile de calciu ionizat și 1,25 dihidroxivitamina D3 la un pacient cu tuberculoză activă și uremie

Calciul ionizat din serum și 1,25(OH)2D3 au fost determinate la diferite momente de timp, de la prima vizită până la un an după terminarea tratamentului antituberculos. Așa cum se arată în figura 1, nivelurile de calciu ionizat s-au corelat cu concentrația de 1,25(OH)2D3 (figura 1).

3.2. Populația studiată

Au fost recrutați 25 de indivizi în grupul de contacte frecvente cu TB și 25 de pacienți în grupul de TB activă. Vârsta medie și raportul dintre sexe nu au fost semnificativ diferite între grupuri. Caracteristicile ansamblului de date sunt prezentate în tabelul 1.

3.3. 1,25(OH)2D3 Cuantificarea 1,25(OH)2D3

Monocitele au fost cultivate cu 25(OH)D3 timp de 3 ore. Apoi, 1,25(OH)2D3 a fost purificată din celule și din mediu și măsurată prin RIA. După cum se arată în figura 2, cantitatea de 1,25(OH)2D3 în grupul cu TB activă a fost de pg/mL (medie ± SD), care a fost semnificativ mai mare decât cea din grupul cu contacte frecvente cu TB () () (). Atunci când monocitele au fost incubate simultan cu MTB și 25(OH)D3 timp de 3 ore, cantitatea de 1,25(OH)2D3 în grupul cu TB activă a scăzut semnificativ în comparație cu cea fără MTB ( și , resp.) () () (a se vedea figura 3). Nu a existat nicio diferență între monocitele cu sau fără expunere la MTB în grupul cu contacte frecvente cu TB ( și , resp.).

Figura 2

Cantitatea de 1,25(OH)2D3 la pacienții cu TB activă și la cei cu contacte frecvente cu TB. Măsurarea RIA a 1,25(OH)2D3 purificată din suspensii de monocite cultivate cu 25(OH)D3 timp de 3 ore. Cantitatea de 1,25(OH)2D3 în grupul de pacienți cu TB activă a fost semnificativ mai mare decât cea din grupul de pacienți cu contacte frecvente cu TB. Fiecare coloană reprezintă media de cuantificare a 1,25(OH)2D3. Barele de eroare reprezintă abaterea standard. *.

Figura 3

Cantificarea 1,25(OH)2D3 la pacienții cu TB activă și la cei cu contacte frecvente de TB cu sau fără antigen M. tuberculosis (MTB). Monocitele au fost pulsate cu 25(OH)D3 cu sau fără MTB. Cantitatea de 1,25(OH)2D3 cu expunere la MTB a scăzut semnificativ în comparație cu cea fără MTB în grupul cu TB activă. Fiecare coloană reprezintă media de cuantificare a 1,25(OH)2D3. Barele de eroare reprezintă deviația standard. *.

4. Discuție

Am observat că nivelurile de 1,25(OH)2D3 s-au corelat cu nivelurile de calciu ionizat la un pacient uremic cu tuberculoză pulmonară. În cazul tuberculozei pulmonare active, nivelurile serice de 1,25(OH)2D3 la acest pacient au fost ridicate, ceea ce, la rândul său, a indus niveluri ridicate de calciu ionizat. După tratament, atât nivelurile de 1,25(OH)2D3, cât și cele de calciu ionizat au scăzut. Teoretic, la un pacient uremic, activitatea renală a CYP27B1 este trivială. Nivelurile serice scăzute de 1,25(OH)2D3 sunt adesea observate la pacienții uremici . În concordanță cu ceea ce a fost observat la om, într-un model de șoarece anefric, se observă, de asemenea, niveluri scăzute de 1,25(OH)2D3 . Cu toate acestea, o sursă extrarenală de CYP27B1 a fost descrisă de mai bine de 6 decenii. Harrell și Fisher au fost printre primii care au descoperit sinteza extrarenală de 1,25(OH)2D3 în condiții patologice . Acești autori au stabilit asocierea dintre homeostazia dereglementată a calciului și sarcoidoza. Macrofagele tisulare s-au dovedit ulterior a fi o sursă extrarenală de producție de 1,25(OH)2D3 în aceste grupuri de pacienți . S-a constatat că un număr din ce în ce mai mare de țesuturi exprimă CYP27B1 de către diferite grupuri de studiu, cum ar fi melanocitele pielii, macrofagele tisulare și celulele reziduale ale placentei . În mod surprinzător, nu toate celulele care exprimă CYP27B1 posedă activitate enzimatică . Pentru a clarifica potențialul ca monocitele circulante să contribuie la niveluri ridicate de 1,25(OH)2D3, am utilizat un biotest ex vivo folosind 25(OH)D3 ca substrat pentru a determina activitatea CYP27B1. Rezultatele noastre demonstrează că activitatea CYP27B1 în monocitele de la pacienții cu TB activă este semnificativ mai mare decât cea din monocitele de la persoanele cu contact frecvent cu TB. Monocitele circulante contribuie la conversia 25(OH)D3 în 1,25(OH)2D3, care este mai activă. În mod curios, vitamina D3 a fost considerată în mod tradițional ca fiind un factor endocrin; 1,25(OH)2D3 produsă la nivel local (tubuli renali) este transportată de sânge pentru a afecta alte țesuturi sau organe, de exemplu, osul. Cu toate acestea, în ultimele decenii, s-a demonstrat că vitamina D3 are și alte roluri decât funcțiile endocrine. 1,25(OH)2D3 produsă de celulele inflamatorii poate stimula expresia receptorilor de vitamina D atât în celulele învecinate, cât și în celulele inflamatorii însele. Prin legarea la receptorul de vitamina D și la receptorul de retinoizi, complexul ligand-receptor se poate lega de promotorii multor gene inflamatorii . Datorită acestor efecte, s-a considerat că vitamina D3 are atât funcții paracrine, cât și autocrine. Spre deosebire de funcția endocrină a vitaminei D3 ca regulator al calciului, funcțiile sale paracrine și autocrine induc celulele inflamatorii să producă peptide antibacteriene și cresc procesul de autofagie . Deoarece 1,25(OH)2D3 este produsă la nivel local și nu este transportată la locurile țintă pentru reglarea homeostaziei calciului, producția sa nu afectează nivelul calciului seric. În mod interesant, în acest studiu, am constatat că 1,25(OH)2D3 produsă de monocite a fost un caz special. Deși 1,25(OH)2D3 produsă de monocite poate acționa la nivel local, aceste celule sunt transportate de sânge către țesuturile din tot corpul. 1,25(OH)2D3 produsă de monocite se comportă, de asemenea, ca un factor endocrin. Este posibil ca monocitele să fie singurele celule din corpul nostru care pot orchestra funcțiile endocrine, paracrine și autocrine ale vitaminei D3. O problemă interesantă este care este contribuția relativă a sursei monocitare de 1,25(OH)2D3 la nivelul total de 1,25(OH)2D3. Dusso et al. au observat că producția maximă de 1,25(OH)2D3 din monocite este trivială (în fmole/oră/microgram ADN) în comparație cu concentrația de 1,25(OH)2D3 în normal (în pmol/mL) . Dar datele provin dintr-un experiment ex vivo, nu știm câte monocite din organism sunt stimulate să producă 1,25(OH)2D3. Noi speculăm că contribuția relativă a sursei monocitare de 1,25(OH)2D3 la nivelul total de 1,25(OH)2D3 este mică în majoritatea circumstanțelor. Chiar și la pacienții cu boală granulomatoasă, doar câțiva dintre ei prezintă simptome clinice de hipercalcemie care rezultă din nivelul ridicat de 1,25(OH)2D3. Cazul nostru indicator este unul dintre aceștia.

Am constatat, de asemenea, că atunci când monocitele de la pacienții cu TB activă sunt cultivate cu antigenul MTB, conversia 1,25(OH)2D3 este semnificativ mai mică decât atunci când nu se adaugă antigen. În grupul celor care au avut contacte frecvente cu TB, nu a existat nicio diferență între a fi cu sau fără antigen MTB. Există două explicații posibile pentru această observație. În primul rând, monocitele amorsate de la pacienții cu tuberculoză activă pot induce mai multă activitate 24(OH) hidroxilază (CPY24) decât omologii lor, care hidroxilează activ 1,25(OH)2D3 în acid calcitroic, atunci când sunt stimulate în continuare cu antigenul MTB. vitamina D3 induce nu numai produse genetice inflamatorii, ci și expresia CPY24 . CPY24 este o enzimă catabolică majoră a vitaminei D3. Activitățile CYP27B1 și CYP24 sunt modulate într-un mod diametral opus pentru a controla nivelurile serice de 1,25(OH)2D3 . Datorită acestei acțiuni concertate, hipercalcemia este rareori observată la pacienți. Grupul celor care au avut contacte frecvente cu TB a demonstrat o acțiune concertată și mai bună, motiv pentru care nu a existat nicio modificare a conversiei 1,25(OH)2D3 după stimularea cu antigenul MTB. O a doua explicație este că activitatea CPY27B1 este epuizată atunci când monocitele sunt restimulate cu antigenul MTB.

expresia ARNm nu a fost determinată în acest studiu din următoarele motive. În primul rând, a fost necesar un număr mare de monocite de la participanți pentru testul biologic ex vivo. Dacă am fi efectuat atât expresia cantitativă a ARNm, cât și testul biologic ex vivo, am fi avut nevoie să recoltăm mai mult de 30 ml de sânge de la fiecare participant. Colectarea acestui volum de sânge a fost respinsă de comitetul nostru de etică. În al doilea rând, după cum s-a indicat anterior, unele țesuturi pot exprima CYP27B1 fără activitate enzimatică detectabilă. nivelurile de ARNm nu sunt întotdeauna corelate cu activitatea enzimatică. În ciuda exprimării CYP27B1 în unele țesuturi, nu a fost detectată nicio activitate enzimatică. În studiile viitoare, ar trebui cuantificate nivelurile CYP27B1 și CYP24 și ale metaboliților vitaminei D3, cum ar fi acidul calcitroic și 24,25(OH)2D3, pentru a clarifica metabolismul vitaminei D3 în procesul fiziopatologic al tuberculozei.

5. Concluzie

În concluzie, nivelurile de calciu s-au corelat cu nivelurile de 1,25(OH)2D3 la un pacient uremic infectat cu tuberculoză. Mai mult decât atât, am constatat că activitatea CYP27B1 în monocite este mai mare în rândul pacienților cu tuberculoză activă decât în rândul celor cu contact frecvent cu tuberculoza.

Aprobare etică

Acest proiect de studiu a fost aprobat de Comitetul de evaluare instituțională al Spitalului Universitar Medical Kaohsiung. Numărul de aprobare este KMUH-IRB-20130103.

Coflict de interese

Autorii declară că nu există niciun conflict de interese pentru această lucrare.

Contribuția autorilor

Yi-Ching Tung și Wen-Chan Tsai au efectuat experimentele și au scris lucrarea. Tsan-Teng Ou și Wen-Chan Tsai au conceput studiul și au colectat specimenele. Toți autorii au citit și au aprobat lucrarea finală.

.