Criptocromii

Circuitele biologice circadiene sunt oscilatoare biochimice care ciclează aproximativ la fiecare 24 de ore și care pot fi resetate (antrenate) prin expunerea la lumină și la alte semnale de mediu. La animale există un oscilator central în creier care controlează comportamentul circadian al întregului organism, precum și oscilatoare periferice în unele țesuturi. Oscilația rezultă dintr-o buclă de feedback transcripțional care implică un set de factori de transcripție ai ceasului, inclusiv timeless (Tim), period (Per), clock (Clk) și Bmal1, precum și criptocromi. Criptocromii sunt exprimați omniprezent în organele și țesuturile tuturor organismelor și, în general, sunt proteine nucleare care reglează expresia genelor. Cei mai bine studiați criptocromi animali sunt criptocromul Cry din Drosophila și criptocromii Cry1 și Cry2 de la șoarece , iar cei doi criptocromi CRY1 și CRY2 din Arabidopsis au fost, de asemenea, studiați pe larg.

Drosophilacriptocromii

Cryptocromul Cry din Drosophila este o proteină predominant nucleară care mediază reglarea ceasului circadian de către lumină , deși poate fi găsită și în citosol . Aceasta reglează ceasul circadian prin interacțiunea directă cu proteina Tim pentru a suprima bucla de reacție negativă a ceasului (figura 3a). Lumina stimulează interacțiunea Cry-Tim, care promovează ubiquitinarea și degradarea dependentă de proteosomi a lui Tim și reprimă formarea heterodimerului Per-Tim. Inhibarea unui heterodimer al proteinelor Clock și Cycle de către heterodimerul Per-Tim este astfel eliberată și faza de oscilație circadiană este resetată (figura 3a). Cu toate acestea, se pare că criptocromul nu este singurul fotoreceptor care antrenează ceasul circadian la Drosophila. Ritmicitatea comportamentală a muștei cribmutante, căreia îi lipsește funcția Cry, poate fi totuși antrenată ca răspuns la lumină, cu excepția cazului în care este eliminată și transducția semnalului de către pigmentul vizual . În plus față de rolul său de fotoreceptor pentru antrenarea oscilatorului central al Drosophilei, Cry are, de asemenea, un rol independent de lumină în funcționarea oscilatorului circadian periferic .

Criptocromii de mamifere

Cele două funcții ale Cry din Drosophila – ca fotoreceptor pentru antrenarea ceasului circadian împreună cu pigmenții vizuali și ca o componentă integrală a complexului proteic al oscilatorului circadian – sunt, de asemenea, caracteristici ale criptocromilor de mamifere. Criptocromii de mamifere sunt proteine predominant nucleare , dar se pot găsi și în citosol . Ca și Drosophila Cry, criptocromii mamiferelor îndeplinesc atât funcții dependente de lumină, cât și independente de lumină în reglarea ceasului circadian. Mai multe observații demonstrează rolul dependent de lumină al proteinelor Cry de mamifere. Șoarecii knock-out lipsiți de una sau de ambele gene Cry au o capacitate redusă sau abolită de a induce expresia unor gene precum per și protooncogenele c-fos ca răspuns la lumină . Mai mult, pupilele șoarecilor mutanți lipsiți atât de Cry1 cât și de Cry2 au răspunsuri reflexe reduse la lumină .

Pe de altă parte, șoarecele dublu mutant Cry1 Cry2 prezintă o ritmicitate aparent normală în condiții de cicluri lumină-întuneric, dar își pierde ritmicitatea instantaneu și complet în condiții de funcționare liberă (întotdeauna în întuneric) . Aceste observații indică faptul că proteinele Cry joacă o funcție esențială și independentă de lumină în oscilatorul circadian central al mamiferelor și că criptocromii nu sunt singurii fotoreceptori care mediază controlul luminos al ceasului. Faptul că criptocromii fac parte integrantă din oscilatorul central al șoarecilor face aproape imposibilă testarea directă a rolului lor în antrenarea ceasului de către lumină. Cu toate acestea, s-a constatat că, într-un mod oarecum analog cu situația din Drosophila, mutantul cry de șoarece își păstrează capacitatea de a media intrarea luminii, cu excepția cazului în care funcția pigmenților vizuali este, de asemenea, întreruptă în același timp. Șoarecii triplu-mutanți care poartă mutații ale ambilor criptocromi împreună cu o mutație degenerativă a retinei sunt aproape aritmici în condiții de cicluri lumină-întuneric . Aceste rezultate demonstrează că proteinele Cry de mamifere sunt într-adevăr implicate în reglarea ceasului circadian de către lumină, dar rolul lor în antrenarea ceasului circadian de către lumină este realizat în mod redundant de către alți fotoreceptori. Pare clar acum că fotoreceptorii suplimentari care acționează împreună cu criptocromii pentru antrenarea oscilatorului circadian al mamiferelor sunt opsinele vizuale din conul bastonului și proteina înrudită melanopsina.

Ca și Cry din Drosophila, criptocromii mamiferelor interacționează fizic cu proteinele ceasului, inclusiv cu regulatorii de transcripție care se leagă de promotori Per, Clk și Bmal1 (figura 3b). Spre deosebire de Drosophila Cry, proteinele Cry de mamifere sunt componente ale buclei de reacție negativă a ceasului circadian (figura 3b). Interacțiunea fizică a criptocromului cu alte componente ale ceasului afectează activitatea, interacțiunea, degradarea sau traficul nuclear al acestora și, în consecință, modifică reglarea transcripțională a genelor ceasului . Dar interacțiunea dintre criptocromi și alte proteine de ceas, cum ar fi Per, Clk și Bmal1, pare să nu fie afectată de lumină, ceea ce sugerează că astfel de interacțiuni ar putea să nu reprezinte mecanismul de foto-încetinire a ceasului circadian, așa cum se întâmplă la Drosophila. În plus față de reglarea directă a transcripției prin interacțiunea fizică cu regulatorii de transcripție care se leagă de promotori, criptocromii pot, de asemenea, să afecteze ceasul circadian prin participarea la reglarea modificărilor histonice , dar modul în care funcționează acest lucru rămâne de elucidat.

Arabidopsiscryptochromes

Arabidopsis CRY1 și CRY2 sunt proteine predominant nucleare care mediază reglarea expresiei genice și antrenarea ceasului circadian ca răspuns la lumină . CRY1 și CRY2 joacă roluri majore în fotomorfogeneza plantelor, cum ar fi inhibarea alungirea tulpinii de către lumina albastră, stimularea expansiunii frunzelor de către lumina albastră și reglarea inițierii florale de către lungimea zilei . Se pare că criptocromii controlează schimbările de dezvoltare la plante prin modificări ale expresiei genelor ca răspuns la lumină. CRY1 și CRY2, împreună, sunt responsabile de modificările de expresie genetică dependente de lumina albastră pentru până la 10-20% din genomul Arabidopsis .

Există cel puțin două mecanisme prin care criptocromii pot afecta modificările de expresie a genelor nucleare ca răspuns la lumină. În primul rând, o moleculă de criptocrom poate interacționa cu proteine asociate cu mașinăria transcripțională pentru a afecta direct transcripția. Arabidopsis CRY2 se leagă de cromatină într-o manieră independentă de secvența ADN ( și M. Maymon și C.L., observații nepublicate), dar nu este clar cum o proteină care interacționează cu cromatina, independentă de secvență, poate regla expresia genică. Spre deosebire de criptocromii animalelor, despre care s-a demonstrat că reglează transcripția prin interacțiuni fizice cu regulatorii de transcripție care se leagă de promotori, nu a fost raportată o astfel de interacțiune pentru criptocromii plantelor. Un model alternativ este acela că criptocromii din plante pot interacționa cu proteine care exercită alte funcții celulare pentru a regla stabilitatea, modificarea și traficul celular al regulatorilor de transcripție. De exemplu, s-a constatat că criptocromii vegetali interacționează cu o ubiquitin ligază E3, COP1, ceea ce sugerează că criptocromii vegetali pot acționa într-un mod încă nedescoperit pentru criptocromii animali . În concordanță cu acest punct de vedere, s-a mai descoperit recent că criptocromii din Arabidopsis mediază suprimarea de către lumina albastră a degradării dependente de proteazom a unui important regulator floral, CONSTANS . Modul exact în care criptocromii fac acest lucru trebuie să fie investigat în continuare.

Mecanism

Mecanismul catalitic al criptocromilor nu a fost complet elucidat, dar unele indicii pot fi găsite în mecanismul fotolazelor CPD, unde FAD joacă principalul rol catalitic . Într-o reacție de reparare a ADN-ului, fotoliza CPD se leagă de dimerul pirimidinic al ADN-ului și îl „răstoarnă” din interiorul duplexului ADN în cavitatea de acces FAD a enzimei, pentru a forma un complex stabil. Celălalt cromofor (pterina sau deazaflavina), numit și cromoforul „antenă”, absoarbe fotonii de lumină albastră sau UV-A și transferă energia de excitație către flavina din FAD. Flavinul în stare excitată donează un electron către dimerul pirimidinei pentru a diviza inelul ciclobutan. Electronul este transferat înapoi la flavin în acest proces, ceea ce duce la regenerarea flavinului în stare de bază. Dinucleotida reparată nu se mai potrivește în cavitatea de acces a FAD, astfel încât se disociază de fotolază. Rolul exact al FAD și al cavității de acces FAD în funcția criptocromilor rămâne neclar, dar este de conceput că ar putea fi, de asemenea, implicat în reacțiile de transfer de electroni.

Deși regiunea PHR care conține cromoforul (cromoforii) este partea cea mai conservată a proteinelor, s-a demonstrat că domeniul carboxi-terminal are un rol în funcția sau reglarea atât a criptocromilor animali, cât și a celor vegetali. Exprimarea domeniilor carboxi-terminale ale criptocromilor din Arabidopsis fuzionați cu enzima marker b-glucuronidază conferă un răspuns constitutiv de creștere la lumină chiar și în întuneric, în absența regiunii PHR . În schimb, regiunile PHR ale criptocromilor din Drosophila și Xenopus sunt active din punct de vedere fiziologic în absența domeniului carboxi-terminal . Domeniul carboxi-terminal al Cry din Drosophila este important pentru stabilitatea proteinei, interacțiunea cu Tim și sensibilitatea fotoreceptorului la semnalele luminoase circadiene , în timp ce domeniul carboxi-terminal al Cry din Xenopus este necesar pentru localizarea sa nucleară .

Criptocromii sunt reglați prin fosforilare. S-a demonstrat că criptocromii Arabidopsis sunt fosforilați ca răspuns la lumina albastră și că acest lucru este asociat cu funcția și reglarea fotoreceptorilor . Mai mult, atunci când CRY1 din Arabidopsis a fost exprimat în celule de insecte, s-a constatat că suferă autofosforilare dependentă de ATP și de lumina albastră. Nu se știe dacă criptocromii animali se leagă, de asemenea, de ATP, deși s-a demonstrat că criptocromii de șoarece sunt fosforilați .

Interacțiunea dintre regiunea PHR a CRY1 din Arabidopsis CRY1 și ATP are câteva caracteristici interesante care amintesc de interacțiunea dintre dimerul de pirimidină și fotoliza: grupările fosfat ale ATP sunt expuse la solvent; părțile adenină și riboză sunt îngropate adânc în cavitatea de acces a FAD; și ATP poate avea un contact mediat de apă cu FAD . Interacțiunea dintre regiunea pHR a Arabidopsis CRY1 CRY1 și ATP nu prezintă, de asemenea, mai multe caracteristici întâlnite în mod obișnuit în interacțiunile proteină-ATP, cum ar fi interacțiunea proteină-fosfat, contactul proteină-Mg2+ și un reziduu de serină în apropiere pentru fosfotransfer. O examinare a topologiei structurii regiunii PHR a CRY1 PHR arată, totuși, că toate aceste caracteristici ar putea fi furnizate de domeniul carboxi-terminal al criptocromului (figura 4). Observarea faptului că domeniile carboxi-terminale bogate în serină ale criptocromilor din Arabidopsis fuzionați cu β-glucuronidază sunt fosforilate constitutiv in vivo (, sugerează că poate avea loc un fosfotransfer de la ATP legat la cavitatea de acces FAD la domeniul carboxi-terminal din apropiere (figura 4a). De asemenea, este posibil ca FAD-ul excitat de fotoni să declanșeze transferul de electroni către nucleotidă și fosfotransferul de la ATP la reziduurile de serină de pe domeniul carboxi-terminal. Deoarece suprafața regiunii PHR este predominant încărcată negativ, în special în locul în care este probabil ca domeniul carboxi-terminal să interacționeze cu acesta, domeniul carboxi-terminal fosforilat ar fi apoi respins de suprafața regiunii PHR, ceea ce ar duce la o schimbare a conformației criptocromului. Această modificare de conformație i-ar permite acestuia să interacționeze cu alte proteine de semnalizare și să propage semnalul luminos (figura 4a). Alternativ, o altă moleculă de criptocrom care se leagă de cavitatea de acces FAD poate, de asemenea, să furnizeze caracteristicile lipsă necesare pentru o interacțiune productivă ATP-criptocrom. Într-adevăr, atât interacțiunea CRY2-CRY2, cât și interacțiunile CRY1-CRY2 pot fi detectate în Arabidopsis (D. Shalitin, X. Yu și C.L., observații nepublicate). Formarea fie a unui homo-oligomer, fie a unui hetero-oligomer de criptocromi ar oferi un mecanism pentru fosfotransferul intermolecular, care poate schimba structura criptocromilor (figura 4b, c).

.