Rezultate
Legatura rapidă a ATP la GroEL, evidențiată de modificările de intensitate a fluorescenței lui GroEL F44C marcat cu Oregon Green 488.
Pentru a monitoriza legarea ATP de GroEL, ne-am bazat pe o variantă GroEL produsă anterior, F44C, care conține o singură cisteină într-o versiune de GroEL altfel „fără cisteină”, în care toate cele 3 cisteine naturale din subunitatea GroEL (aminoacizii 138, 458 și 519) au fost înlocuite cu alanină (21). După cum este ilustrat în Fig. 1A, F44 se află într-o buclă îndreptată în sus în cavitatea centrală GroEL la nivelul domeniului ecuatorial, poziționată între ramurile β antiparalele ecuatoriale în apropierea capetelor cărora se află reziduuri care formează contacte de legătură de hidrogen cu fosfatul terminal al ATP-ului legat prin intermediul unei molecule de apă și al unui ion de potasiu. Bucla și reziduul 44 sunt astfel dispuse să fie afectate de absența sau de prezența ATP. Un studiu anterior a raportat că o substituție F44W ar putea raporta asupra legării ATP (16). Aici, am utilizat mutantul F44C, despre care s-a observat anterior că este pe deplin funcțional, după cum indică capacitatea plasmidului care îl codifică de a salva creșterea unui mutant cu deficit de GroEL și capacitatea proteinei purificate de a efectua o repliere eficientă a proteinei dependentă de ATP/GroES in vitro (21). F44C a fost marcată cu Oregon Green 488 (OG488)-maleimidă la un nivel de ocupare de ≈70%. A rămas pe deplin funcțional în medierea replierei malat dehidrogenazei (MDH) in vitro, prezentând o cinetică aproape identică cu cea a GroEL WT. Rata de rotație a ATP în stare de echilibru a mutantului modificat, numit EL44-OG, a fost, de asemenea, asemănătoare cu cea a WT GroEL (Fig. S1B).
ATP se leagă rapid de GroEL nelegat și de inelul trans al complexului GroEL/GroES/ADP. (A) Diagramă cu panglici a unei porțiuni din domeniul ecuatorial al subunității 1 GroEL din complexul GroEL/GroES/ADP/AlFx (ref. 24; cod ID PDB: 1PCQ) care arată poziția lui F44. (B) Spectrele de emisie ale EL44-OG singur (urmă neagră), amestecat cu 500 μM ADP (verde) și amestecat cu 500 μM ATP (roșu). Excitația a fost la 496 nm. (C) Schimbarea fluorescenței EL44-OG la amestecarea cu ATP în flux oprit. Urma a putut fi ajustată (linia albă) ca sumă a 2 exponențiale cu constantele de viteză indicate. Schema indică OG (verde) în domeniile ecuatoriale. (D) Dependența ratei mai rapide de modificare a fluorescenței de concentrația de ATP. Constantele de viteză din experimentele ca în C (negru) și E (roșu) la diferite concentrații de ATP sunt reprezentate grafic în funcție de concentrația de ATP, rezultând linii drepte cu pante egale cu respectivele constante de viteză de ordinul doi pentru legarea ATP, așa cum se arată. (E) Schimbarea fluorescenței complexului EL44-OG/GroES/ADP la amestecarea cu ATP în flux oprit. D reprezintă ADP în inelul cis, GroES este colorat în gri, iar ATP (roșu) este prezentat adiacent inelului la care se leagă. (F) La fel ca în E, cu excepția EL44-OG nelegat. (G) La fel ca în E, dar cu MDH legat la inelul trans, reprezentat ca o linie albastră în schemă. (H) Experiment de amestecare cu flux oprit similar cu cel din E, cu excepția faptului că GroEL din complex a fost marcat cu OG pe poziția 315 în afara domeniilor apicale. Aici, urma a putut fi ajustată ca o singură exponențială cu rata indicată. (I) Experiment cu flux oprit utilizând versiunea cu un singur inel a GroEL, SR1, marcată cu OG pe o cisteină substituită la poziția 315 (a se vedea tabelul S1 pentru un rezumat al ratelor și amplitudinilor.)
Spectrele de emisie de fluorescență ale EL44-OG (excitat la 496 nm) au arătat că adăugarea de ATP a produs o scădere mare a intensității fluorescenței în stare de echilibru (≈65% în 500 μM ATP), însoțită de o mică deplasare în albastru a maximului de emisie (Fig. 1B). În schimb, ADP a produs o scădere mai mică a intensității, susținând faptul că γ-fosfatul din ATP are un efect specific asupra conformației buclei care conține 44.
La amestecarea în flux oprit a 0,5 mM ATP cu EL44-OG, s-a observat o scădere rapidă a intensității de emisie, cu o curbă care se poate adapta ca sumă a 2 exponențiale, una cu o constantă de viteză de ≈100 s-1 și alta cu o constantă de viteză de 4 s-1 (Fig. 1C). Prima rată indică o interacțiune rapidă a ATP cu GroEL nelegat și corespunde ratelor raportate anterior atât pentru F44W (ref. 16; 80 ± 5 s-1), cât și pentru alte 2 versiuni de GroEL substituite cu triptofan: Y485W, în care un triptofan a fost înlocuit în altă parte în domeniul ecuatorial (ref. 18; 123 ± 2 s-1) și R231W (ref. 17; 80 s-1), în cazul în care un triptofan a fost substituit în aspectul orientat spre cavitate al domeniului apical (GroEL este altfel lipsit de triptofan). Așa cum era de așteptat, rata de interacțiune a ATP cu EL44-OG a depins de concentrația de ATP (Fig. 1D), iar pentru faza mai rapidă a fost determinată o constantă de viteză bimoleculară de 2 × 105 M-1 s-1 . Faza cinetică mai lentă, de asemenea dependentă de concentrația de ATP, corespunde probabil celei de-a treia faze fluorescente observate pentru R231W și Y485W de GroEL la legarea ATP (17, 18). Posibilitatea ca această fază să reflecte hidroliza ATP a fost exclusă prin utilizarea unei chaperonine D398A/EL44-OG cu deficiență de hidroliză.
Schimbare de fluorescență la fel de rapidă la legarea ATP la inelul trans deschis al complexului asimetric GroEL/GroES/ADP.
În condiții fiziologice, starea normală de acceptor pentru ATP este inelul trans deschis al unui complex asimetric GroEL/GroES/ADP. Cu amestecarea în flux oprit, am observat că rata de legare a ATP la inelul trans al complexelor EL44-OG/GroES/ADP a fost similară cu cea a unui inel GroEL nelegat (Fig. 1E, comparați cu Fig. 1F). Aici, a existat, de asemenea, o dependență de concentrația de ATP asemănătoare cu cea a EL44-OG nelegat (Fig. 1D).
Polipeptidul substrat legat la inelul trans nu afectează rata de legare a ATP.
Într-o serie de studii in vitro, polipeptida non-nativă a fost mai întâi complexată la inelul trans deschis al unui complex asimetric ADP GroEL/GroES asimetric înainte de adăugarea de ATP și GroES în exces (8, 9). În aceste condiții, legarea ATP urmată de legarea GroES este în mod clar capabilă să încapsuleze polipeptidul nenavigant și să dirijeze plierea productivă. Este rata de legare a ATP într-un astfel de context afectată de proteina substrat legată? Pentru a testa acest lucru, MDH nenaturală a fost legată la complexele asimetrice EL44-OG/GroES/ADP, iar apoi s-a adăugat ATP cu amestecare în flux oprit. În aceste condiții, rata de modificare a intensității fluorescenței a fost practic identică cu cea a complexului EL44-OG/GroES/ADP în absența polipeptidei (comparați Fig. 1G cu Fig. 1E). Astfel, prezența unui substrat nenatural legat de domeniile apicale ale inelului trans nu are nici un efect detectabil asupra intrării rapide a ATP în buzunarele ecuatoriale de legare a nucleotidelor din inelul trans.
Mișcarea rapidă a domeniului apical însoțește legarea ATP.
Când ATP se leagă rapid de GroEL, acest lucru determină o ajustare semnificativă în domeniile apicale de legare a polipeptidelor pe aceeași scară de timp rapidă sau modificările apicale ca răspuns la legarea ATP sunt relativ lente, astfel încât efectele legării ATP trebuie considerate ca având loc într-un moment ulterior? Studiul anterior al R231W a indicat deja că efectele apicale au apărut rapid cu acest mutant (17). În studiul de față, de asemenea, o sondă fluorescentă pe aspectul exterior al domeniilor apicale, la distanță de situsul de legare a ATP din interiorul cilindrului (GroEL E315C într-un fond de cisteină zero marcat cu OG), a arătat o schimbare rapidă a intensității fluorescenței, pe aceeași scară de timp ca și legarea ATP. De exemplu, a fost observată o constantă de viteză de 20 s-1 pentru un complex asimetric GroEL315-OG/GroES/ADP la o concentrație de ATP de 150 μM (Fig. 1H, comparați cu 25 s-1 în Fig. 1E). Astfel de modificări apicale au avut loc în același inel la care este legat ATP, deoarece analiza unei versiuni cu un singur inel modificat cu OG a lui E315C, SR315-OG, a arătat o rată similară de modificare a intensității fluorescenței (Fig. 1I). Viteza mișcării apicale a fost, de asemenea, dependentă de concentrația de ATP, cu rate paralele cu cele de legare a ATP (Fig. S2, comparați cu Fig. 1D).
Legatura relativ lentă a polipeptidei substrat măsurată prin FRET.
Pentru a permite o comparație a vitezei de legare a polipeptidelor substrat non-nativ cu cea de legare a ATP, am măsurat în continuare viteza de legare a proteinelor substrat la complexele asimetrice GroEL/GroES/ADP folosind FRET. Au fost studiate trei proteine substrat diferite: MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa) și o formă dublu-mutantă a proteinei de legare a maltozei (DM-MBP; 41 kDa). Toate cele 3 proteine se comportă ca proteine substrat stringente la 25 °C, necesitând prezența GroEL, GroES și ATP pentru a ajunge la forma nativă (3). În absența acestora, are loc o agregare cantitativă. Pentru monitorizarea legăturii, s-a măsurat FRET între proteina substrat marcată cu cumarină propil maleimidă (CPM; donator) pe un reziduu de cisteină (a se vedea Materiale și metode) și EL44-OG (acceptor). Excitându-se la maximul de excitație pentru CPM (384 nm), au fost colectate spectrele de emisie pentru substraturile marcate cu CPM (donator) în timp ce erau legate de GroEL neetichetat (Fig. 2A, DM-MBP-CPM ca exemplu, traseu negru), pentru EL44-OG complexat cu substrat neetichetat (Fig. 2A, acceptor marcat, traseu albastru) sau pentru complexe cu substrat marcat cu CPM legat de EL44-OG (Fig. 2A, traseu roșu). Atât pentru DM-MBP-CPM cât și pentru MDH-CPM, a existat o stingere puternică a donatorului la asocierea cu EL44-OG; în același timp, a apărut un semnal substanțial de acceptor.
Legătura relativ lentă a unui substrat non-nativ, DM-MBP, la GroEL nelegat și la inelul trans al complexului GroEL/GroES/ADP. (A) Spectrul de emisie al DM-MBP marcat cu CPM (donor) în timp ce este legat de GroEL (D, urmă neagră), spectrul de emisie al EL44-OG (acceptor) în timp ce este complexat cu DM-MBP non-nativ (A, urmă albastră) și spectrul de emisie al complexului DM-MBP-CPM cu EL44-OG (D-A, urmă roșie), toate excitate la 384 nm, maximul de excitație pentru CPM. (B) Modificarea fluorescenței canalului donator la amestecul cu flux oprit al DM-MBP-CPM non-nativ cu EL44-OG. Linia albastră reprezintă DM-MBP non-nativ, iar D din cercul galben reprezintă eticheta CPM. (C) Dependența constantei de viteză mai rapidă pentru legarea DM-MBP de concentrația GroEL. Constantele de viteză din experimente ca în B la diferite concentrații de GroEL (negru) sau din experimente similare folosind complexul GroEL/GroES/ADP (roșu) sunt reprezentate grafic în funcție de concentrația GroEL, rezultând linii drepte cu pante (constante de viteză de ordinul doi) de 6,11 × 106 M-1s-1 și, respectiv, 5,36 × 106 M-1s-1. (D) Modificarea fluorescenței donatorului la amestecarea în flux oprit a DM-MBP-CPM non-nativ cu complexul EL44-OG/GroES/ADP și 500 μM ATP. În mai multe experimente (n = 6), rata fazei mai rapide a fost în mod constant ușor mai rapidă pentru inelul trans în prezența ATP decât în absența acestuia: 2,08 ± 0,11 vs. 1,36 ± 0,22 (tabelul S2).
La amestecarea în flux oprit a 125 nM DM-MBP-CPM cu 125 nM EL44-OG, s-a observat o scădere a intensității de emisie a donatorului, cu o curbă care ar putea fi ajustată ca suma a 2 exponențiale, una cu o constantă de viteză de 1,33 s-1 și cealaltă cu o constantă de viteză de 0,65 s-1 (Fig. 2B). Rata mai rapidă (k1) a fost dependentă de concentrația de chaperonină (Fig. 2C), dar cea mai lentă nu a fost dependentă. La o concentrație GroEL de 125 nM (Fig. 2B), viteza de legare a polipeptidei substrat (k1 = 1,33 s-1) este de 60 de ori mai lentă decât viteza de legare a ATP (100 s-1 la 500 μM ATP; Fig. 1C). Deși se preconizează că rata de legare a substratului ar fi de câteva ori mai mare la concentrația fiziologică de GroEL de 1-2 μM (Fig. 2C), rata de legare a ATP ar fi, de asemenea, probabil oarecum mai mare, având în vedere că concentrația fiziologică de ATP este de câțiva milimolari (Fig. 1D). Astfel, este probabil ca rata de sosire a ATP în condiții fiziologice să fie de cel puțin 10 ori mai mare decât rata de sosire a substratului.
Într-un alt test, adăugarea de ATP în același timp cu DM-MBP marcat fluorescent a avut un efect reproductibil de creștere a ratei de legare a DM-MBP (Fig. 2D și Tabelul S2). În concluzie, ordinea fiziologică de adăugare la un inel trans pare să cuprindă sosirea rapidă a ATP urmată de sosirea mai lentă a proteinei substrat. Această ordine este opusă celei programate în studiile recente, în care polipeptida a fost inițial legată la inelul trans și apoi s-a adăugat ATP (8, 9). Are ordinea de adăugare vreun efect măsurabil asupra replierei proteinei substrat? Pentru a testa acest lucru, am efectuat experimente de ordine de adiție și am măsurat recuperarea enzimei native în condiții de rotație practic unică.
Recuperare mai amplă a stării native atunci când ATP este adăugat mai întâi, urmat de polipeptidă, în comparație cu ordinea opusă.
Un experiment de ordine de adiție a fost efectuat folosind versiunea cu un singur inel a GroEL, SR1, permițând o analiză „single-round”. Polipeptida captată de SR1 este aproape cantitativ pliată la forma nativă, după legarea GroES, în interiorul cavității cis cu durată lungă de viață a complexului stabil SR1/GroES (10, 11). Astfel, SR1 ar putea fi incubat cu ATP și polipeptidă non-nativă în orice ordine, urmată de adăugarea de GroES, iar gradul de recuperare a proteinei native ar putea fi măsurat atât în funcție de ordinea de adăugare, cât și de intervalul dintre adăugări (Fig. 3A). Pentru aceste teste, GroES a fost adăugat la 2 secunde după ATP/polipeptidă pentru a permite finalizarea interacțiunilor inițiale. Într-un experiment inițial, am observat în mod reproductibil că, atunci când Rubisco non-nativ a fost adăugat mai întâi, urmat 2 secunde mai târziu de ATP, gradul de recuperare a Rubisco în formă nativă a fost de numai ≈30%. Acest lucru a fost comparat cu >60% recuperare atunci când ATP a fost adăugat mai întâi și cu recuperarea de ≈70% observată atunci când ATP și GroES au fost adăugate la un complex binar Rubisco-SR1 preformat (produs prin incubarea timp de 10 minute a Rubisco non-nativ cu SR1). Acest lucru sugerează că, în contextul unei reacții ciclice în care inelul trans al unui complex GroEL/GroES/ADP acceptor este deschis și disponibil pentru legarea polipeptidelor timp de numai ≈1-2 s înainte ca GroES să se lege, mobilizarea domeniilor sale apicale prin legarea rapidă de ATP favorizează legarea polipeptidelor non-native. Ordinea opusă, adăugarea polipeptidei cu 2 s înainte de ATP, pare să fie mai puțin favorabilă pentru legare, chiar dacă domeniile apicale mobilizate de ATP au fost ulterior disponibile timp de 2 s înainte de adăugarea GroES. În special, atunci când intervalul dintre adaosurile de Rubisco și ATP a fost mărit la 4 s (Fig. 3A), efectul ordinii de adăugare a fost atenuat, cinetica și amploarea recuperării fiind acum egale cu cele ale adăugării ATP mai întâi, probabil în funcție de o legare mai extinsă a polipeptidei în timpul intervalului dinaintea adăugării ATP. Deși amploarea recuperării Rubisco în studiile de ordine de adiție cu un interval de 2 s a fost semnificativ afectată, cinetica de recuperare a stării native în interiorul complexelor stabile SR1/GroES a fost similară, în concordanță cu un efect asupra legării proteinei substrat și nu asupra vitezei de pliere în camera încapsulată.
Legăturarea ATP înaintea Rubisco non-nativ îmbunătățește randamentul de pliere prin creșterea amplorii și a vitezei de legare. (A) Recuperarea activității Rubisco cu diferite ordine de adăugare. SR1 a fost incubat cu ATP timp de 2 sau 4 s înainte de a se adăuga Rubisco non-nativ (dRUB); alternativ, Rubisco non-nativ a fost adăugat mai întâi la SR1, urmat de ATP 2 sau 4 s mai târziu. Pentru ambele comenzi, GroES a fost adăugat 2 s mai târziu, iar alicotele au fost prelevate la momentele indicate pentru testarea activității Rubisco . Pentru comparație, s-a efectuat un test „standard” de repliere Rubisco prin incubarea SR1 cu Rubisco non-nativ timp de 10 minute înainte ca ATP și GroES să fie adăugate împreună pentru a începe replierea (simboluri negre). (B) Gradul de legare a 35S-Rubisco la SR1 cu diferite ordine de adăugare. Experimentele au fost efectuate cu diferite ordine de adăugare ca în A, cu excepția faptului că, după ce s-a adăugat GroES și apoi ADP-AlFx (pentru a stabiliza complexul ternar), amestecurile au fost cromatografiate pe o coloană Superose 6 și s-a determinat radioactivitatea fracțiunilor. Radioactivitatea totală recuperată la poziția de eluție a complexului SR1/GroES/ADP-AlFx/Rubisco este raportată ca procent din radioactivitatea încărcată pe coloană. În analizele identice cu intervale de 4 s, ambele ordine de adăugare au produs o recuperare de ≈70%, ceea ce corespunde recuperării activității din A (nu se arată). (C) Rata de legare a Rubisco la un inel SR1 în absența ATP, măsurată prin FRET. Fluorescența donatoare a Rubisco-CPM după amestecarea în flux oprit cu o moleculă SR1 D398A cu deficiență de hidroliză SR1 D398A care poartă fluoroforul OG pe o Cys-44 substituită. (D) Rata de legare a Rubisco la SR398A în prezența ATP (adăugat înainte de încărcare în seringa cu flux oprit). (E) Rata de legare a Rubisco la un inel SR398A atunci când este adăugat simultan cu ATP.
Legare mai amplă a Rubisco în cazul în care se adaugă mai întâi ATP.
Pentru a aborda efectul ordinii de adăugare asupra legării proteinei substrat, am folosit Rubisco marcat cu 35S și am măsurat cantitatea care a devenit legată de SR1 în timpul incubărilor în ordinea adăugării, folosind filtrarea pe gel a amestecurilor de produse finale pentru a separa complexele stabile SR1/GroES/Rubisco de polipeptida nelegată. Aceasta a arătat că ≈10.000 cpm 35S-Rubisco s-au legat atunci când 40.000 cpm 35S-Rubisco (125 nM) au fost adăugate cu 2 secunde înainte de ATP și că ≈30.000 cpm s-au legat atunci când ATP a fost adăugat cu 2 secunde înainte de Rubisco (Fig. 3B). Această ultimă măsură de legare a fost, de asemenea, obținută atunci când complexele binare SR1-Rubisco formate pe o perioadă de 10 min au fost apoi incubate împreună cu ATP și GroES (Fig. 3B). Aceste măsurători ale gradului de legare a substratului sunt astfel paralele cu gradul de recuperare a activității enzimatice (a se compara Fig. 3B cu Fig. 3A) și susțin concluzia că, în contextul unui interval de 2 s între adăugarea de ATP/polipridă, adăugarea de ATP favorizează inițial o legare mai eficientă a proteinei substrat.
Rata mai mare de legare a Rubisco la un inel de chaperonină expus la ATP.
Observația de mai sus privind o mai mare amploare a legării Rubisco într-un experiment de ordine de adăugare în care ATP este adăugat inițial sugerează că rata de asociere a Rubisco cu domeniile apicale mobilizate cu ATP ar putea fi mai mare. Pentru a testa acest lucru, a fost utilizată o versiune D398A a SR1 cu deficit de hidroliză ATP, cu OG atașat la o cisteină substituită în poziția 44 (într-un fond C138A), pentru a raporta prin FRET rata de legare a Rubisco marcată cu CPM (Fig. 3 C-E). Am observat că rata de legare a Rubisco, efectuată în aceleași condiții ca și în cazul experimentelor de ordine de adiție de mai sus, a fost de 2 ori mai mare în prezența față de absența ATP (comparați Fig. 3D cu Fig. 3C). Atunci când ATP și Rubisco non-nativ au fost adăugate simultan, reflectând situația fiziologică, rata de legare a Rubisco a fost asemănătoare cu cea din cazul în care ATP a fost adăugat înainte de Rubisco (Fig. 3E, comparați cu Fig. 3D). Aceste date susțin faptul că Rubisco se asociază mai rapid cu un inel ale cărui domenii apicale au fost mobilizate cu ATP și că, în condiții fiziologice în care sunt prezenți atât ATP, cât și substrat nenatural, domeniile apicale mobilizate cu ATP sunt cele care acționează în legarea substratului.
.