Ce este secvențierea în timp real cu o singură moleculă (SMRT)?

De Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Revizuit de Christian Zerfaß, Ph.D.

Skip to:

• Cum funcționează secvențierea SMRT?
• Studierea metilării ADN-ului la bacterii; o aplicație a secvențierii SMRT

Secvențierea ADN-ului funcționează prin utilizarea ADN polimerazei pentru a adăuga nucleotide la un șablon. Există mai multe tehnologii disponibile pentru secvențierea ADN-ului. Un astfel de exemplu este secvențierea în timp real cu o singură moleculă, sau secvențierea SMRT.

Cercetător care examinează o lamelă de transparență a secvenței de ADN. Credit: Shawn Hempel /

Cum funcționează secvențierea SMRT?

Ca și în cazul altor tehnologii de secvențiere a ADN-ului, primul pas după extracția ADN-ului este pregătirea unei „biblioteci”. Acest proces pregătește ADN-ul pentru secvențiere; în acest caz, adaptorii sunt adăugați la fiecare capăt al unei molecule de ADN bicatenar, ceea ce permite efectiv ca ADN-ul să devină un șablon circular monocatenar. Acest lucru înseamnă apoi că ADN-ul poate fi secvențiat în mod continuu.

Această bibliotecă de ADN, sau ADN șablon, este apoi introdusă într-un secvențiator de ADN care conține „ghiduri de undă în mod zero” care au ADN polimeraza imobilizată la un capăt. O singură moleculă de ADN este apoi imobilizată în aceste ghiduri de undă în mod zero, iar ADN polimeraza începe să adauge noi nucleotide la un șir de ADN sintetizat de novo, complementar ADN-ului șablon. Bazele din aceste nucleotide sunt marcate, iar încorporarea acestor baze în șirul de ADN în creștere determină emisia de lumină. Această emisie de lumină este apoi citită în timp real și, deoarece emisia de la fiecare bază este diferită, acest lucru permite identificarea bazei specifice.

Principalul avantaj al secvențierii SMRT este generarea de citiri lungi de secvențiere de mare precizie, ceea ce îmbunătățește asamblarea genomurilor întregi. Acest lucru se datorează faptului că citirile de secvențiere mai lungi înseamnă că este nevoie de mai puțină „construcție” pentru a asambla genomul.

Studiul metilării ADN-ului la bacterii; o aplicație a secvențierii SMRT

Ce este metilarea ADN-ului?

Adaosul unei grupări metil la ADN, cunoscut și sub numele de metilare, are loc în toate regnurile vieții. Există trei nucleotide metilate prezente în bacterii; m5C (C5-metil-citozină, care este prezentă și la eucariote), m6A (N6-metil-adenină) și m4C (N4-metil-citozină, care se găsește numai la bacterii). Metilarea are loc după sinteza de noi șiruri de ADN și are loc la nucleotide specifice.

Grupările metil ies în afara dublei elice a ADN-ului și, prin urmare, pot avea un impact asupra legăturii dintre ADN și proteinele de legare a ADN-ului. Aceasta, la rândul său, are un impact asupra proceselor care includ replicarea cromozomilor, repararea nepotrivirilor de ADN, precum și sincronizarea transcrierii genelor și formarea de linii epigenetice.

Mecanisme epigenetice: metilarea sau acetilarea ADN-ului poate activa sau nu transcrierea genei. Image Credit: ellepigrafica /

De ce este importantă metilarea ADN-ului la bacterii?

Bacteriile sunt infectate de viruși, de aceea au nevoie de un mecanism de protecție pentru a depăși infecțiile virale. Aici intervin sistemele de modificare prin restricție; acest sistem este alcătuit dintr-o enzimă de restricție, care descompune ADN-ul în locuri specifice, și o ADN-metiltransferază, care adaugă o grupare metil la adenină (A) sau citosină (C).

În majoritatea sistemelor de modificare prin restricție, ADN-metiltransferaza acționează pentru a proteja ADN-ul bacterian de enzima de restricție. Prezența ADN-metiltransferazei înseamnă că ADN-ul bacterian devine metilat, în timp ce ADN-ul viral infectant nu este. Acest lucru înseamnă, la rândul său, că ADN-ul viral este degradat de către enzima de restricție, în timp ce ADN-ul bacterian este protejat datorită faptului că enzima de restricție nu acționează asupra ADN-ului metilat. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că există enzime de restricție care acționează asupra ADN-ului modificat.

Studii recente au sugerat că ar putea exista roluri suplimentare pentru sistemele de restricție-modificare. De exemplu, eliminarea anumitor sisteme de restricție-modificare a dus la o modificare a expresiei genelor, care este legată de diferența de metilare a ADN-ului. Sistemele de restricție-modificare pot provoca, de asemenea, rupturi dublu-catenare și mutații C-T, influențând astfel evoluția bacteriilor. Mai recent, au fost dezvoltate tehnologii care sunt capabile să determine metilarea unui întreg genom bacterian, cunoscut sub numele de „metilom”.

Cum se determină metilomul folosind secvențierea SMRT?

Potrivit faptului că secvențierea SMRT oferă rezultate în timp real, aceasta poate fi utilizată pentru a detecta modificările ADN, inclusiv metilațiile. ADN polimeraza încorporează nucleotide la o rată constantă, dar această rată poate fi modificată dacă nucleotidul din șablon a fost modificat. Acest lucru poate fi observat în timpul procesului de secvențiere.

Blow at al. a folosit secvențierea SMRT pentru a cartografia modificările ADN în 230 de microorganisme. Modificările pe care le-au căutat au inclus m5C, m6A și m4C. Autorii au constatat că 93% din aceste microorganisme prezentau metilarea ADN-ului și au găsit, de asemenea, 834 de motive care erau metilate. Acest lucru le-a permis autorilor să identifice care motive sunt țintele a 620 de ADN metiltransferaze.

În mod interesant, autorii au observat că, în timp ce 48% dintre organismele studiate aveau o ADN metiltransferază, nu a existat nicio dovadă că ar fi fost prezentă și o enzimă de restricție. Prin urmare, este posibil ca metilarea ADN-ului să joace un rol important în reglarea genomului, sau un alt rol important în microorganisme care încă nu a fost identificat.

Further Reading

• All DNA Sequencing Content
• DNA Sequencing
• DNA Sequence Assembly
• DNA Sequence Assembly
• DNA microarray
• High-throughput DNA Sequencing Techniques

Scris de

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama este cercetător și scriitor științific. A obținut doctoratul de la Universitatea din Bath, Marea Britanie, în urma unei teze în domeniul microbiologiei, în care a aplicat genomica funcțională la Staphylococcus aureus . În timpul studiilor de doctorat, Maho a colaborat cu alți profesori universitari la mai multe lucrări și chiar a publicat unele dintre lucrările sale proprii în reviste științifice evaluate de colegi. De asemenea, ea și-a prezentat lucrările la conferințe academice din întreaga lume.

Citate

.