Bookshelf

Factori corectivi și semnale de recunoaștere

Un sistem model pentru terapia de substituție enzimatică a apărut în urma studiilor asupra fibroblastelor de piele cultivate derivate de la pacienții cu boli de depozitare a mucopolizaharidelor (MPS). Astfel de fibroblaste au prezentat o acumulare excesivă de glicozaminoglicani, care a fost interpretată ca fiind datorată unei degradări inadecvate a acestor macromolecule . S-a descoperit în mod întâmplător că un amestec de fibroblaste derivate de la pacienți cu MPS I (sindromul Hurler) și MPS II (sindromul Hunter) avea un model normal de metabolizare a glicozaminoglicanilor (figura 1) . Se știa că cele două boli sunt distincte din punct de vedere genetic, MPS I fiind moștenită în mod autosomal recesiv, iar MPS II fiind o afecțiune legată de X, ceea ce i-a determinat pe Fratantoni et al. să formuleze ipoteza că fibroblastele din diferite genotipuri își furnizau reciproc produsul genetic lipsă. Studii ulterioare au arătat că nu este necesar ca celulele distincte din punct de vedere genetic să fie în contact una cu cealaltă pentru o astfel de corecție încrucișată, deoarece mediul condiționat de una dintre ele ar putea fi corectiv pentru cealaltă. Strategia de corecție încrucișată ar putea fi extinsă la boli înrudite – celulele care s-au corectat reciproc ar avea un genotip diferit, în timp ce celulele care nu s-au corectat reciproc ar avea același genotip (dar a se vedea excepția importantă de mai jos).

Deoarece sindromul Hurler a fost postulat ca fiind o boală de stocare lizozomală pe baza observării lizozomilor hepatici dramatic umflați la pacienții afectați , Fratantoni și colab. au emis ipoteza că „factorii de corecție” din mediul condiționat ar putea fi enzimele lizozomale care au fost secretate de o linie celulară și endocitarizate de cealaltă. Cu toate acestea, factorii corectivi nu corespundeau niciunei enzime lizozomiale cunoscute la momentul respectiv (această situație s-a schimbat câțiva ani mai târziu, când a fost descoperită o MPS cu deficiență de β-glucuronidază ). S-a întreprins purificarea factorilor corectivi Hurler și Hunter, nu din mediul condiționat, ci din urină, un fluid corporal relativ bogat în enzime lizozomale. Funcția a fost atribuită factorilor purificați prin utilizarea unei varietăți de metode biochimice, rezultând că factorii corectivi Hurler și Hunter au fost numiți α-l-iduronidază și, respectiv, iduronat sulfatază .

Celulele care au avut nevoie de factorul corectiv Hurler pentru a-și normaliza metabolismul glicozaminoglicanic (de la pacienții cu sindrom Hurler și cu sindrom Scheie ) au fost, de asemenea, deficitare în activitatea α-l-iduronidazei ). Corecția fibroblastelor Hurler a fost însoțită de absorbția de α-l-iduronidază. Ca un bun augur pentru terapia de substituție enzimatică, absorbția a fost remarcabil de eficientă și doar o cantitate foarte mică de α-l-iduronidază a trebuit să fie internalizată pentru a asigura o corecție completă.

Acesta ar fi putut fi sfârșitul poveștii, cu excepția unei mici discrepanțe în modelul de eluție al activității enzimatice și al activității corective dintr-o coloană de hidroxiapatită , sugerând că cele două activități ale factorului de corecție Hurler nu erau tocmai identice. Urmărind această discrepanță, Shapiro et al. au separat α-l-iduronidaza în fracții corective și necorective pe o coloană de heparină-Sepharoză, indicând că factorul corectiv avea o anumită caracteristică care nu era necesară pentru activitatea catalitică, dar era necesară pentru absorbție. În mod similar, au fost găsite mai multe forme de β-glucuronidază, care diferă în ceea ce privește absorbția și activitatea corectivă .

Existența unui semnal specific pentru absorbția unei enzime lizozomiale a fost sugerată de rezultatele unui studiu asupra unei afecțiuni nou descoperite care seamănă cu MPS – numită boala celulelor de incluziune (boala celulelor I) din cauza incluziunilor proeminente cu densitate de fază în fibroblastele cultivate . În timp ce aceste fibroblaste prezentau deficiențe multiple ale enzimelor lizozomiale, mediul din jurul lor conținea un exces mare de enzime lizozomiale . Cu toate acestea, enzimele secretate de fibroblastele bolnave de boala celulelor I nu au fost endocitate de alte celule și nu au fost corective; probabil, le-a lipsit semnalul pentru absorbția în lizozomi . Deoarece un număr de enzime lizozomiale au fost afectate de acest defect genetic unic (boala celulelor I se moștenește în mod autosomal recesiv), s-a presupus că semnalul este o modificare post-translațională a proteinelor enzimatice. De asemenea, s-a emis ipoteza că este de natură glucidică, deoarece poate fi distrus printr-un tratament ușor cu periodat. Conceptul unui sistem de recunoaștere bazat pe carbohidrați a fost puternic influențat de descoperirile lui Ashwell și ale colegilor cu privire la rolul carbohidraților în absorbția glicoproteinelor circulante de către ficat .

Prezența unui semnal specific recognoscibil a implicat un proces saturabil, mediat de receptori, și a sugerat că absorbția enzimelor lizozomiale ar urma cinetica Michaelis-Menten. Era de așteptat ca analogii semnalelor de recunoaștere să se comporte ca inhibitori competitivi ai absorbției. Această așteptare a fost investigată prin absorbția α-l-iduronidazei și a β-glucuronidazei de către fibroblastele deficitare corespunzătoare. Descoperirea de către Kaplan et al. că cel mai bun inhibitor al absorbției β-glucuronidazei a fost mannoza-6-fosfat (M6P) și sugestia lor că M6P a fost (sau a făcut parte din) semnalul de recunoaștere mult căutat, a fost surprinzătoare, deoarece nu fusese raportată anterior existența niciunui carbohidrat fosforilat pe glicoproteinele mamiferelor. Aceasta a fost imediat confirmată pentru absorbția α-l-iduronidazei și a altor enzime lizozomiale, folosind o varietate de metode biochimice; dovada finală a venit din analiza structurală a grupărilor de carbohidrați fosforilați . Semnalul descoperit prin endocitoză s-a dovedit a fi, de asemenea, semnalul pentru direcționarea hidrolazelor născute către lizozomi .

Defectul în boala celulelor I, care împiedică celulele să sintetizeze semnalul de recunoaștere M6P, s-a dovedit a fi o deficiență a primei dintre cele două enzime implicate în sinteza semnalului M6P . Au fost descoperiți doi receptori pentru M6P; chimia și biologia receptorilor M6P și rolul lor în traficul celular au devenit un domeniu larg și foarte activ al biologiei celulare . Aceste subiecte fac obiectul mai multor recenzii, inclusiv al capitolelor 3 și 5 din acest volum. Semnificația sistemului M6P pentru terapia de substituție enzimatică va fi discutată mai jos.

Concomitent cu aceste studii asupra fibroblastelor de cultură, un sistem in-vivo a dus la descoperirea unui alt semnal de absorbție a enzimelor lizozomiale. S-a constatat că mai multe enzime lizozomale, injectate intravenos la șobolani, sunt eliminate rapid din circulație; cu toate acestea, ele persistau mult mai mult timp dacă erau pretratate cu periodat sau dacă erau coinjectate cu o agalactoglicoproteină . Din nou, s-a emis ipoteza că carbohidrații furnizează semnale pentru recunoașterea specifică. În acest caz, zahărul cheie pentru recunoaștere a fost mannoza , iar absorbția a avut loc în celulele reticuloendoteliale din ficat . S-a demonstrat că receptorul de mannoză, care recunoaște N-acetilglucozamina și l-fucoza, precum și mannoza, se află pe suprafața macrofagelor . Este de un oarecare interes istoric faptul că experimentele de absorbție a invertazei, care au figurat în mod proeminent în propunerea inițială a terapiei de substituție enzimatică (a se vedea mai sus ), au avut succes deoarece invertaza este o glicoproteină cu lanțuri de manan care sunt recunoscute de receptorul de mannoză .

.