Rezultate
Raportăm datele demografice și fenotipul clinic a 36 de pacienți AME confirmați genetic de la International Consortium of Rare Steroid Disorders. Majoritatea pacienților au fost de origine omanită (22 din 36) și persană (6 din 36), 75% dintre ei provenind din căsătorii consangvine, în principal în Oman (Fig. 1B și Tabelul S1). Vârsta mediană a diagnosticului de AME a fost de 4,6 ani (interval: 0,1-15), iar cohorta a fost distribuită în mod egal pentru ambele sexe. Majoritatea pacienților (86%) s-au născut la termen, 76% dintre ei fiind născuți mici pentru vârsta gestațională. Fig. 1A arată că, în cohorta noastră, au existat șase mutații de tip missense, o inserție, două de deleție și trei mutații de tip frameshift, precum și două indels. De așteptat din patofiziologia AME, presiunea arterială medie de prezentare a fost ridicată peste percentila 90 pentru toți subiecții (Fig. 1C). Nivelul mediu al potasiului seric la diagnostic a fost scăzut la 2,72 mmol/L (interval: 1,5-4,1 mmol/L), în timp ce bicarbonatul seric a fost ridicat la 29,5 mmol/L (interval: 20-38 mmol/L) (Fig. 1 D și E). Nivelurile serice de aldosteron au fost de așteptat scăzute (Fig. 1F), cu doi pacienți cu niveluri ridicate din motive neclare. În plus, nivelurile de renină au fost scăzute, cu excepția a doi pacienți (10,4 și 14 ng/mL/h) care se aflau sub tratament (tabelul S1). Într-un subset de 29 de pacienți, raportul mediu (THF + aloTHF)/THE, reprezentând principalii metaboliți urinari ai cortizolului și cortizonului, a fost semnificativ ridicat la 19 (interval: 3-55, normal: 1,0) (Fig. 1G). De remarcat este faptul că 27 din 36 (75%) de pacienți au prezentat, de asemenea, nefrocalcinoză. Nefrocalcinoza poate apărea în urma hipokaliemiei cronice de lungă durată, așa cum s-a observat, de exemplu, în sindromul Bartter de tip III (14).
Pentru a înțelege dacă fenotipul clinic al deficienței HSD11B2 ar putea fi prezis prin examinarea modificărilor structurii enzimatice induse de o anumită mutație HSD11B2, am efectuat analize in silico utilizând trei HSD17B1 estrogeni care au prezentat o similaritate de secvență de 27% cu HSD11B2 pe 284 de aminoacizi (Fig. S1A). Modelul HSD11B2 uman HSD11B2 a prezentat un motiv de pliere Rossmann caracteristic conservat de legare a NAD (Fig. S1B) cu un situs de legare a substratului adiacent (Fig. S1 C și D). Simulările MD de 500-ns ale formelor monomerice și dimerice ale HSD11B2 au indicat un model stabil cu proteină pliată în mod stabil (Fig. S1 E-H). Am utilizat software-ul Internal Coordinate Modeling (ICM) (www.molsoft.com) (18) pentru a determina ΔΔG a mutațiilor missense găsite la pacienții cu AME sau a mutațiilor proiectate experimental. Toate mutațiile (Fig. 2A) au prezentat o creștere a valorilor ΔΔG, sugerând pierderea stabilității și a funcției proteinei (Fig. 2B).
Mutații disruptive care afectează interfața dimerică a HSD11B2. (A) Modelul dimerului HSD11B2 uman construit folosind structurile cristaline HSD17B1 existente: 1IOL (cocristalizată cu 17β-estradiol) care a fost cea mai completă structură, fără reziduuri lipsă; 1JTV (1,5 Å) care a fost cocristalizată cu testosteron și a prezentat o rezoluție mai mare decât 1IOL (2,3 Å); și 1FDV care a fost cocristalizată cu coenzima NAD. Sunt indicate pozițiile tuturor reziduurilor mutante cunoscute. (B) Valorile ∆∆G pentru mutațiile HSD11B2 severe (roșu) sau ușoare (negru). (C) La interfața dimerului, se formează două perechi de ioni R186-E190 între simetria inversă dublă a subunităților adiacente. În cazul monomerului (D), se formează o pereche de ioni intrahelicală, care este similară cu puntea de sare R112 și E120 formată în șabloanele HSD17B1. (E) Pozițiile spațiale ale mutațiilor (albastru) cartografiate pe o subunitate. Cele două subunități sunt colorate în mod distinct (maro și albastru). NAD+ (galben) și cortizolul (verde) sunt ilustrate ca bastoane. Interacțiunea pereche de ioni la interfața dimerului este stabilă pe toată durata simulării de 500 de s (F). Cu toate acestea, se observă o anumită fluctuație în interacțiunea intrahelicoidală din cauza modificărilor conformaționale ale monomerului (G). (H) R186 realizează interacțiuni de perechi de ioni cu E190 din subunitatea adiacentă. Mutația R186C duce la pierderea interacțiunii de pereche ionică. O pereche ionică intrahelică formată între R186 și E190 în monomer este, de asemenea, pierdută. (I) Mutația A237V sporește hidrofobicitatea la interfață. (J) D244 formează o interacțiune de pereche ionică intrasubunitară cu R336, precum și legături de hidrogen cu R360 din subunitatea adiacentă. Lanțul lateral polar neîncărcat al asparaginei din mutant nu este în măsură să asigure stabilitatea structurală. (K) Grupul OH din mutația L251S realizează o legătură de hidrogen cu R361 din subunitatea adiacentă, sporind astfel interacțiunea la interfața dimerului. (L) Legătura de hidrogen formată între D176N și T200 îmbunătățește starea de dimer inactiv.
HSD11B2 există ca homodimer în starea sa inactivă (13). Patru reziduuri – și anume, R186, E190, A237 și R336 – se află la interfața dimerului și, prin urmare, ar putea interfera cu formarea dimerului (Fig. 2C). Reziduurile R186 și E190 sunt poziționate la interfața dimerului pe helixul α4. O interacțiune cu perechea de ioni intersubunitate (R186-E190) se formează ca urmare a simetriei inversate duble a subunității adiacente (Fig. 2D), asemănătoare cu perechea de ioni R112-E120 din HSD17B1 (15⇓-17). Este important de remarcat faptul că această interacțiune s-a dovedit a fi stabilă și a fost menținută pe parcursul simulărilor MD de 500-ns (Fig. 2 E-G). În plus, s-a constatat că interacțiunea stabilizează helixul α4 și menține flexibilitatea în jurul situsului de legare a coenzimei. Astfel, mutația R186C duce la pierderea perechii ionice intersubunitare și împinge echilibrul spre formarea unei enzime monomerice active (Fig. 2H). De asemenea, aceasta împiedică formarea interacțiunii intrahelicală a perechii de ioni și permite astfel destabilizarea elementelor structurale din jurul situsului de legare a coenzimei.
Există alte câteva mutații perturbatoare la această interfață a dimerului care implică reziduurile A237, D244, L251 și D176. Reziduul A237 este înconjurat de L241 și V239 din ambele subunități HSD11B2. Mutația sa în Val sporește hidrofobicitatea acestui grup și întărește starea dimerică inactivă a enzimei (Fig. 2I). Reziduul D244 nu numai că creează o punte de sare intrasubunitară cu R336 care ține împreună helixul α5 și foile β7, ci și interacțiuni de legătură de hidrogen cu R360 din subunitatea adiacentă (Fig. 2J). Mutația sa în Asn scade puterea interacțiunii R360, ceea ce duce la pierderea punții saline cu R366; acest lucru, la rândul său, afectează stabilitatea proteinei. În mod similar, mutația unui lanț lateral hidrofob L251 în grup hidroxil al Ser crește polaritatea și formează o legătură de hidrogen cu grupurile de lanțuri laterale încărcate pozitiv ale lui R361; acest lucru îmbunătățește legarea dimerului (Fig. 2K). În cele din urmă, mutația lui D176 în Asn creează o legătură de hidrogen între asparagină și T200, sporind astfel starea inactivă a dimerului (Fig. 2L).
Mutațiile reziduurilor HSD11B2 care formează buzunarul de legare a substratului sau a coenzimei (NAD+) au demonstrat în studii in vitro că elimină activitatea enzimei (19) și cauzează AME severă. De exemplu, Y226 este situat în buzunarul de legare a substratului (Fig. 3A). Lanțul lateral aromatic al fenolului formează interacțiuni hidrofobe cu inelul aromatic al substratului. Mutația Y226N înlocuiește acest reziduu cu un reziduu nearomatic, ceea ce duce la pierderea stivuirii hidrofobe, care interferează cu legarea substratului (Fig. 3A). În plus, această mutație schimbă lanțul lateral din hidrofob în hidrofil, ceea ce este nefavorabil pentru legarea unui substrat hidrofob. Mutația A221V înlocuiește lanțul lateral scurt cu un lanț lateral ușor mai voluminos de Val, interferând astfel cu legarea substratului prin reducerea volumului buzunarului, în timp ce mutația A221G scade hidrofobicitatea și introduce flexibilitate în jurul buzunarului de legare rigid (Fig. 3B).
Interferența cu legarea coenzimei sau a substratului la HSD11B2. (A) Tirozina de la poziția 226 formează peretele situsului de legare a substratului și conferă hidrofobicitate. O mutație la N226 duce la pierderea stivuirii hidrofobe, ceea ce o face nefavorabilă pentru legarea substratului. (B) Mutația A221V reduce volumul buzunarului de legare a substratului, în timp ce A221G a crescut flexibilitatea în jurul situsului de legare. (C) În mutația L179R, lanțul lateral de guanidiniu încărcat pozitiv realizează legături de hidrogen cu lanțurile de mărime T184 și E172, reducând astfel flexibilitatea în jurul situsului de legare a NAD+. (D) Lanțul lateral hidroxi-fenil al lui Y232 realizează legături de hidrogen cu grupul hidroxil al zahărului riboză și cu lanțul lateral al lui N171. Aceste legături de hidrogen sunt esențiale, deoarece mutațiile la fenilalanină, serină sau cisteină nu sunt tolerate. Mutația la fenilalanină îndepărtează gruparea hidroxil și duce la pierderea legăturii de hidrogen, în timp ce mutația la serină cu un lanț lateral mai scurt duce la creșterea distanței dintre gruparea OH și NAD+ și, din nou, împiedică o legătură de hidrogen eficientă; ambele mutații duc la inactivitatea enzimei. (E) Lanțul lateral carboxil al acidului aspartic în mutația G89D provoacă ciocniri sterice severe cu fracțiunea de zahăr ribozic a adenozinei din NAD și afectează legarea coenzimei. (F) Lanțul lateral mai voluminos din mutația K236R scade dimensiunea buzunarului de legare a coenzimei, făcându-l nefavorabil pentru legarea optimă a NAD+.
Modelul nostru arată că grupul polar 17-OH din cortizol este băgat într-o regiune hidrofobă înconjurată de Y226, P227 și L229. Această grupare hidroxil este absentă în corticosteron, ceea ce duce la interacțiuni hidrofobe îmbunătățite și la o afinitate de legare de ∼10 ori mai mare pentru HSD11B2 în comparație cu cortizolul (Fig. S2A). În afară de rinichi, HSD11B2 este exprimată și în placentă. Deși receptorul mineralocorticoid nu este exprimat în acest țesut, HSD11B2 inactivează cortizolul pentru a elimina efectele sale inhibitoare de creștere și proapoptotice în timpul dezvoltării embrionare. În timpul sarcinii, nivelul ridicat de progesteron din circulația maternă se poate lega de HSD11B2 și poate modula activitatea acestuia. Acest lucru se poate traduce în efectele oricăror mutații de pierdere a funcției care perturbă legarea progesteronului asupra greutății la naștere. De exemplu, mutația A221V afectează grav legarea progesteronului mai mult decât a cortizolului din cauza ciocnirilor sterice dintre Val și grupările metil proiectate în progesteron (Fig. S2B). Foarte interesant, constatăm că cei doi pacienți cu mutațiile A221V au fost mici pentru vârsta gestațională (Tabelul S1). De asemenea, mutația A221G afectează indirect legarea progesteronului prin modificarea structurii situsului de legare. În mod similar, mutația Y226N este mai dăunătoare pentru legarea progesteronului, deoarece reduce interacțiunile hidrofobe dintre scheletul de progesteron și inelul hidroxifenil al tirozinei (Fig. S2B). În schimb, P227 asigură un suport structural indirect pentru situsul de legare, iar mutația la Leu are efecte similare atât pentru cortizol, cât și pentru progesteron (Fig. S2B).
Există patru mutații care rezidă în și perturbă situsul de legare a coenzimei, afectând astfel în mod grav activitatea HSD11B2. Lanțul lateral al reziduului L179 este în mod normal poziționat spațial într-o curbă scurtă între foaia β4 și helixul α4 (Fig. 3C). Permițând interacțiuni cu lanțurile laterale hidrofobe ale V174 și L282, aceste interacțiuni fac ca situsul de legare a coenzimei să fie mai flexibil. Mutația la Arg introduce un lanț lateral de guanidiniu, care permite interacțiuni cu lanțul lateral al grupului carboxil al lui E172 și cu lanțul lateral al grupului hidroxil al lui T184 (Fig. 3C), introducând astfel rigiditate în cotitură și scăzând flexibilitatea necesară pentru funcționarea optimă a enzimei (7). Situat în buzunarul de legare a coenzimei, Y232 este un reziduu foarte conservat în motivul de pliere Rossmann (20), ceea ce sugerează că mutația sa va fi în detrimentul activității enzimei (21). Lanțul lateral hidroxil-fenil al lui Y232 formează legături de hidrogen importante cu N171 și NAD+, menținând coenzima în poziția corectă pentru funcția sa catalitică (Fig. 3D). Această interacțiune este întreruptă în cazul mutației Y232C care cauzează AME severă. Importanța acestui reziduu în activitatea enzimei a fost confirmată independent prin mai multe mutații proiectate (21) (Fig. 3D) (Fig. 3D). În cazul mutației G89D, lanțul lateral carboxilic al lui Asp prezintă ciocniri sterice severe cu fracțiunea de zahăr ribozică a adenozinei, ceea ce afectează legarea NAD+ (Fig. 3E). O altă mutație modificată K236R duce la întreruperea legăturii cu NAD (Fig. 3F). Deși păstrează capacitatea de a interacționa cu NAD+ prin legături de hidrogen, mutația abolește activitatea enzimatică (21).
Majorările în stabilitatea structurală a HSD11B2 perturbă structura sa terțiară, provocând o atenuare marcantă a activității enzimatice și o AME severă. Reziduul L250 este poziționat în helixul α5, iar lanțurile sale laterale se află într-un buzunar hidrofob strâns, înconjurat de lanțurile laterale ale L204, F246, W253, V255 și V257 (Fig. 4A). Reziduurile buzunarului hidrofob sunt blocate de o interacțiune de pereche de ioni între R208 și E249. Introducerea unui lanț lateral Pro rupe helixul α5 prin introducerea rigidității. Acest buzunar este, de asemenea, prea strâns pentru a găzdui lanțul lateral mare și voluminos de guanidiniu al Arg (Fig. 4A). O pierdere ulterioară de hidrofobicitate în această regiune afectează stabilitatea structurală. O altă interacțiune stabilă intrahelicoidală de perechi de ioni se formează între D144 și R147 (Fig. 4B). Această interacțiune permite helixului α3 să se împacheteze strâns cu foile β adiacente în apropierea situsului de legare a NAD+. Mutația D144V duce la pierderea acestei interacțiuni și destabilizează aranjamentul de împachetare (Fig. 4B). Împachetarea hidrofobă este, de asemenea, întreruptă în mutația F185S, când lanțul lateral aromatic al fenilalaninei, înconjurat de reziduurile hidrofobe V182, C188 și M189, este înlocuit cu un lanț lateral polar al serinei (Fig. 4C). În mod similar, lanțul lateral hidrofob al lui L363, înconjurat de M347, I350 și F362, este poziționat într-un helix-turn-helix (Fig. 4D). Mutația L363P întrerupe helixul și mediul structural local.
Mutații care afectează stabilitatea HSD11B2. (A) L250 este poziționat pe helixul α5 și lanțul lateral este înconjurat într-un buzunar hidrofob restrâns. O mutație în arginină sau prolină voluminoasă care introduce o distorsiune a helixului nu este tolerată. (B) Mutația D144V duce la pierderea interacțiunii perechii de ioni D144-R147 și destabilizează aranjamentul de împachetare a helixului α3 în apropierea situsului de legare a NAD. (C) Lanțul lateral polar din mutația F185S întrerupe împachetarea hidrofobă formată de V182, C188 și M189. (D) Reziduul hidrofob L363 este poziționat într-un helix-turn-helix, înconjurat de M347, I350 și F362. Mutația în prolină distruge helixul și mediul structural local. (E) În mutantul A328V, lanțul lateral al valinei prezintă ciocniri sterice în cadrul buzunarului hidrofob. (F) Lanțul lateral al grupului hidroxil din S180 realizează interacțiuni cu atomii din coloana vertebrală și cu lanțul lateral din T184. Un lanț lateral de fenilalanină abolește aceste interacțiuni și conferă flexibilitate buclei. (G) Interacțiunile pereche de ioni R208-E249 mențin împreună elicele α4 și α5. Mutanții R208H/C sunt incapabili să formeze această interacțiune. (H) Lanțul lateral carboxilic al lui D223 realizează legături de hidrogen cu lanțurile laterale ale lui Q261 și R337. Mutația în Asn întrerupe legătura de hidrogen cu R337. (I) Mutația R213C duce la pierderea interacțiunilor de legături de hidrogen formate între lanțul lateral al argininei și atomii din coloana vertebrală a lui A331 și L329. (J) R337 realizează o interacțiune de pereche ionică cu D223 și, de asemenea, o legătură de hidrogen cu Y339. În timp ce lanțul lateral al lizinei păstrează o capacitate redusă de a forma legături de hidrogen cu Y339, o mutație în histidină, cisteină sau alanină abolește complet interacțiunea de pereche de ioni R337-D223. (K) Lanțul lateral hidroxi-fenil al lui Y338 realizează o legătură de hidrogen cu atomii din coloana vertebrală a lui D327 și A328. Aceste interacțiuni mențin pozițiile spațiale ale lui α7 și β7. O mutație în histidină sau fenilalanină duce la pierderea acestor interacțiuni și introduce flexibilitate.
În plus, mai multe mutații pot perturba împachetarea proteinei HSD11B2 pentru a afecta stabilitatea prin introducerea unui reziduu mai voluminos. Reziduul A328 formează o interacțiune hidrofobă cu V215, I260, I325 și Y338 (Fig. 4E). Prin înlocuirea alaninei cu un reziduu Val mai voluminos, mutația A328V provoacă ciocniri sterice cu lanțul lateral al lui I260 și Y338 din foile β înconjurătoare (Fig. 4E). Reziduul S180 este poziționat pe o buclă, iar lanțul lateral al grupului său hidroxil interacționează cu lanțul lateral și cu azotul din coloana vertebrală a lui T184 (Fig. 4F). Această catenă laterală se află într-un spațiu foarte restrâns și restricționează acomodarea oricărui reziduu mai voluminos, ceea ce provoacă ciocniri sterice, de fapt, fără a modifica structura proteinei. Astfel, o catenă laterală Phe cu un inel aromatic voluminos, ca în mutația S180F, nu este tolerată în această poziție (Fig. 4F).
Multiple legături de hidrogen și punți de sare între reziduurile polare stabilizează structura terțiară a enzimei HSD11B2. Anumite mutații determină o pierdere a acestor interacțiuni, rezultând o enzimă inactivă și o AME severă. De exemplu, puntea de sare dintre R208 și E249 este critică (Fig. 4G). Pierderea acesteia, ca în cazul mutațiilor R208C și R208H, destabilizează proteina și duce la o boală severă (Fig. 4G). În mod similar, D223 formează o punte de sare cu R337 (Fig. 4H). Prin înlocuirea acestei punți de sare cu o legătură mai puțin puternică, o legătură de hidrogen, mutația D223N schimbă reziduul încărcat negativ cu un reziduu polar neîncărcat, ceea ce duce la o atenuare marcată a activității in vitro (22). Acest lucru sugerează, de asemenea, că puntea de sare joacă un rol crucial în menținerea stabilității și activității HSD11B2. Lanțurile laterale ale R213 formează legături de hidrogen cu atomii din coloana vertebrală a reziduurilor A331 și L329 (Fig. 4I). Prin diminuarea acestor legături de hidrogen, care ajută la menținerea structurii terțiare a proteinei, mutația R213C afectează stabilitatea enzimei (Fig. 4I).
Gruparea Arg/Tyr de la reziduurile 335-339 a fost implicată anterior în menținerea stabilității proteinei, deși mecanismul precis a rămas neclar (23). Mutații care implică aceste reziduuri au fost raportate la pacienții cu AME, inclusiv R337C și Y338H. Simulările modelelor monomerice și dimerice HSD11B2 sugerează că reziduul R337 formează o interacțiune de punte de sare cu D223 și legături de hidrogen cu grupul OH al lui Y339 (Fig. 4J). Interacțiunile lor par a fi importante pentru menținerea unui pliaj corect și a stabilității proteinei. Astfel, mutația sa în Cys abolește atât puntea de sare, cât și legătura de hidrogen pentru a destabiliza enzima și a provoca o AME severă. Mutațiile acestui reziduu prin inginerie genetică arată, de asemenea, că R337K, care menține polaritatea și sarcina pozitivă, reduce activitatea enzimei cu 70%, în timp ce R337A, care este similar cu R337C prin faptul că are lanțuri laterale neîncărcate și scurte, inactivează complet HSD11B2 (23) (Fig. 4J). În același grup Arg/Tyr, mutația lui Y338 în His inactivează enzima pentru a provoca AME severă. Modelul nostru sugerează că acest reziduu Tyr formează interacțiuni hidrofobe cu A328 și legături de hidrogen cu D327 (Fig. 4K). Ambele interacțiuni contribuie la menținerea stabilității proteinei, astfel încât înlocuirea lui Tyr cu His, de exemplu, inactivează HSD11B2. Acest lucru se datorează faptului că, deși Y338H păstrează capacitatea de legătură de hidrogen, are lanțuri laterale mai scurte care destabilizează enzima. În mod similar, înlocuirea lui Tyr cu Phe într-o construcție modificată Y338F nu este tolerată. Aici, interacțiunile hidrofobe sunt păstrate, dar legătura de hidrogen este abolită (23). În cele din urmă, R337 și Y338 din clusterul Arg/Tyr sunt, de asemenea, foarte conservate în multe specii; astfel, este puțin probabil ca orice modificare a acestor reziduuri să fie tolerată (23).
Sunt raportate mai multe mutații care cauzează o formă mai ușoară de AME cu manifestări clinice și biochimice mai puțin severe. S-a demonstrat că construcțiile mutante relevante au menținut activitatea HSD11B2 in vitro (4, 19, 24), în concordanță cu fenotipul clinic mai puțin sever. Din punct de vedere structural, aceste mutații pot fie să întrerupă indirect legarea substratului (cum ar fi mutația P227L la unul dintre pacienții noștri), fie să modifice structura proteică (cum ar fi mutațiile R279C și R359W) pentru a atenua, dar nu pentru a aboli activitatea enzimatică (Fig. 5). În mod notabil, în timp ce reziduul P227 nu se află într-o poziție care interacționează direct cu substratul, poziționarea sa adiacentă la reziduul Y226 sugerează că ar putea avea un rol în legarea substratului (Fig. 5A). De fapt, acest reziduu formează „cotul” în regiunea buclei, menținând conformația situsului activ și, de asemenea, menține Y226 în poziția corectă pentru a interacționa în mod optim cu substratul. Mutarea acestui reziduu în Leu (P227L) întrerupe încolăcirea și modifică poziționarea lui Y226 (Fig. 5A).
Mutații HSD11B2 care cauzează AME ușoară de tip 2. (A) P227 formează o încovoiere în buclă și ajută la poziționarea corectă a lui Y226 pentru a interacționa în mod optim cu substratul. O creștere a flexibilității buclei în mutația P227L duce la o aliniere greșită a lui Y226. (B) Legătura de hidrogen dintre R279 și N171 este una dintre multele care mențin împreună foile β4 și β6. De asemenea, aceasta orientează lanțul lateral al lui N171 pentru a interacționa cu NAD+. Mutarea la cisteină duce la pierderea acestor interacțiuni. (C) Interacțiunile R359-I350 mențin helixul-turn-helixul. Mutația R359W introduce flexibilitate în regiune.
Două mutații neconservative considerate a perturba structura terțiară a HSD11B2 au fost identificate la pacienții cu AME tip 2. R279 formează o legătură de hidrogen cu coloana vertebrală a N171, care ajută la menținerea și stabilizarea mediului proteic local (Fig. 5B). Înlocuirea lui R279 cu un reziduu care nu formează o legătură de hidrogen, ca în cazul mutației R279C, duce la o atenuare ușoară, dar nu la eliminarea totală a activității HSD11B2 (24), în concordanță cu un fenotip clinic ușor (Fig. 5B). O altă mutație neconservativă, R359W, modifică proprietățile lanțului lateral de la încărcat la hidrofob. Aceasta modifică interacțiunea locală în cadrul structurii proteice, în care lanțul lateral încărcat pozitiv al lui R359 formează o legătură de hidrogen cu oxigenul carbonil din coloana vertebrală a lui I350 (Fig. 5C). O pierdere a acestei interacțiuni contribuie la creșterea flexibilității structurale, cauzând atenuarea activității enzimei. De remarcat este faptul că atât R279C cât și R359W cauzează o perturbare minimă a interacțiunilor intramoleculare și apar în apropierea suprafeței proteinei.
.