Abstract
Dizaharidazele (DS) sunt enzime de la marginea periei încorporate în membrana microviloasă a enterocitelor din intestinul subțire. În boala celiacă (CD) netratată, se observă o scădere generală a activităților DS. Acest manuscris trece în revistă diferite aspecte ale activităților DS în DC: utilitatea lor în diagnostic și aplicarea lor la testele de toxicitate in vitro. Acesta din urmă nu a fost niciodată stabilit în cercetarea CD. Cu toate acestea, având în vedere progresele recente în tehnicile organoidale ale intestinului subțire, DS ar putea fi utilizată ca biomarker pentru studii in vitro. Aceasta include stabilirea de celule epiteliale auto-reînnoitoare crescute din țesuturi, care exprimă markeri de diferențiere, inclusiv enzimele de la marginea periei. Determinarea activităților DS duodenale ar putea furniza informații suplimentare în timpul diagnosticării CD: (i) să cuantifice severitatea leziunilor histologice observate, (ii) să ofere valori predictive pentru gradul de atrofie viloasă a mucoasei și (iii) să ajute la diagnosticarea DC în cazul în care se observă modificări histologice minore. DS poate furniza, de asemenea, informații suplimentare pentru a evalua răspunsul la o dietă fără gluten, deoarece o creștere marcată a activităților acestora are loc la patru săptămâni după începerea acesteia. Diferiți factori endogeni și exogeni care afectează DS ar putea fi, de asemenea, relevanți atunci când se ia în considerare investigarea rolului DS în alte afecțiuni, inclusiv sensibilitatea la gluten necoelacică și deficiențele DS.
1. Introducere
La unele persoane, simptomele gastrointestinale, inclusiv diareea, sunt legate de ingestia anumitor forme de carbohidrați alimentari. Simptomele sunt atribuibile uneia sau mai multor deficiențe enzimatice ale mucoasei intestinale mici care hidrolizează dizaharidele . Printre acestea se numără deficitul de lactază (de tip congenital și la adult), deficitul de sucrase-izomaltază, deficitul de maltază-glucoamilază și deficitul de trehalază. Cu excepția deficienței de lactază la adult, celelalte deficiențe enumerate mai sus sunt relativ rare . Alte afecțiuni, inclusiv boala celiacă (DC), care determină leziuni ale intestinului subțire, pot determina reducerea activităților dizaharidazei (DS). S-a sugerat, de asemenea, că deficiențele secundare de DS pot explica, eventual, simptomele la pacienții cu CD care au vilozitățile intacte .
Lactoza, care este digerată de enzima lactază de la marginea periei, este unul dintre carbohidrații cu lanț scurt slab absorbiți, adesea denumiți FODMAP (oligo-, di-, monosacaride și polioli fermentescibili). S-a demonstrat că un aport redus de FODMAP îmbunătățește simptomele gastrointestinale la pacienții cu sensibilitate la gluten necoeliac (NCGS) . S-a demonstrat că alte componente decât glutenul din grâu ar putea fi importante în NCGS, și anume inhibitorul de amilază-tripsină . Lipsa biomarkerilor pentru această afecțiune ar putea determina cercetătorii să investigheze rolul potențial al enzimelor de la marginea periei, cum ar fi lactaza.
În cazul DC netratate, se observă o scădere generală a activităților DS . Înainte de apariția testelor serologice, activitățile DS ale intestinului subțire erau parametri de laborator importanți pentru a ajuta la diagnosticarea CD. Determinarea activității DS individuale a fost, de asemenea, crucială pentru diagnosticul diferențial al tulburărilor metabolice înnăscute. Măsurarea activității lor ajută la distincția dintre deficiențele DS primare și secundare . Tipurile primare de deficiențe DS constituie „erori înnăscute de metabolism” ale unei enzime specifice . Un exemplu în acest sens este deficiența congenitală de lactază, în care există niveluri normale de maltază și zaharază cu lactază redusă. CD este o deficiență secundară de DS, deoarece toate DS sunt reduse din cauza leziunilor induse de gluten la nivelul mucoasei intestinului subțire .
Creșterea marcantă a activităților DS apare la patru săptămâni după începerea unei diete fără gluten (GFD), dar activitățile lor sunt din nou reduse dacă pacienții celiaci revin la o dietă normală . La pacienții cu CD tratată, instilarea intraduodenală de gluten produce modificări histologice caracteristice și o reducere marcată asociată a activităților dizaharidazei în decurs de 3,5 ore . Reducerea activităților DS se corelează cu gradul histologic al biopsiei, astfel încât DS ar putea fi utilizată ca biomarker al CD.
Acest manuscris trece în revistă diferite aspecte ale activităților DS în CD: utilitatea lor în diagnostic și aplicarea lor la testele de toxicitate in vitro. În plus, descriem progresele recente în tehnicile organoidale din intestinul subțire, inclusiv cocultura cu celule imune, care oferă o oportunitate interesantă de a dezvolta modele in vitro de ultimă generație pentru cercetarea CD. În acest model, enzimele de la marginea periei ar putea fi utilizate ca markeri ai patogenezei CD.
2. Aspecte de diagnosticare a activităților dizaharidazei intestinului subțire în CD
Standardul de aur pentru diagnosticul CD și urmărirea efectului GFD este examinarea biopsiilor duodenale împreună cu serologia CD, inclusiv transglutaminaza tisulară. Măsurarea activităților DS oferă informații suplimentare în momentul diagnosticului și în timpul urmăririi pentru a evalua răspunsul la un GFD . În plus, s-a demonstrat că determinarea activităților DS ar putea ajuta la diagnosticarea CD în cazul în care se observă modificări histologice mai ușoare, inclusiv anomalii Marsh I și II în biopsiile intestinului subțire .
2.1. Valori predictive pozitive și negative ale atrofiei mucoasei viloase
Măsurarea activităților enzimatice de la marginea periei oferă un instrument obiectiv suplimentar pentru a evalua severitatea anomaliilor histologice la pacienții celiaci netratați . Activitățile DS duodenale sunt buni predictori ai gradului de atrofie a vilozităților mucoase în CD. Valorile predictive pozitive pentru atrofia vilozitară moderată sau severă sunt următoarele:(i)90% pentru maltază (maltază U/g proteină)(ii)86% pentru sucrasă (<40 U/g proteină)(iii)71% pentru lactază (<20 U/g proteină).
Diminuarea activităților maltazei și sucrasei are astfel o valoare predictivă pozitivă ridicată pentru gradul de atrofie vilozitară mucoasă. Valorile predictive ale activității lactazei sunt mai scăzute, probabil din cauza prezenței deficitului primar de lactază la pacienții celiaci. Niciun pacient cu activități DS în intervalul normal nu a prezentat o atrofie viloasă severă .
2,2. Vindecarea mucoasei în CD cu o dietă fără gluten (GFD)
Este bine stabilit faptul că activitățile enzimelor de la marginea periei sunt reduse la pacienții celiaci netratați. Cu toate acestea, activitățile se recuperează în timpul remisiunii, în special la patru săptămâni după începerea unui GFD . Este important de remarcat răspunsurile diferite între DS și un GFD; are loc o creștere marcată a activităților alfa-glucozidazelor, în timp ce activitatea lactazei rămâne scăzută la mulți pacienți . Peña și colab. au demonstrat că răspunsul la lactază la o alimentație cu GFD este variabil, uneori prezentând o recuperare completă în câteva luni, dar alteori rămânând deprimată timp de ani de zile . Vârsta pacientului este de mare importanță în ceea ce privește rata de recuperare a activității lactazei. Pacienții cu vârste mai mici de 30 de ani prezintă, de obicei, o recuperare completă în decurs de câteva luni, în timp ce majoritatea pacienților mai în vârstă prezintă o recuperare mică sau deloc în acest interval de timp . Persistența unor activități scăzute ale lactazei în ciuda unei bune ameliorări histologice a fost demonstrată în alte studii pentru unii pacienți, în special adulți .
Cu excepția lactazei , măsurarea DS poate oferi un indice cantitativ de ameliorare a mucoasei intestinului subțire ; creșterea lor se corelează bine cu recuperarea mucoasei pe baza histologiei biopsiei intestinului subțire . În plus față de urmărirea histologică și serologică, măsurarea activităților DS oferă un instrument potențial suplimentar pentru a evalua tratamentul CD cu un AGE . Activitatea zaharazei este cel mai bun indicator al răspunsului mucoasei la un AGE. Cu toate acestea, este interesant de observat că, chiar și după doi ani de tratament al CD cu un GFD, activitatea zaharazei în duodenul distal nu crește la nivelul controalelor, deși efectele clinice sunt observate mai devreme . În general, activitățile enzimatice din mucoasa intestinală subțire a pacienților cu CD în remisiune sunt mai scăzute decât cele din grupurile de control, care au fost comparate în funcție de vârstă, sex și locul biopsiei . Cu toate acestea, pacienții celiaci care urmează o alimentație glicemică au niveluri semnificativ crescute de maltază și sucrasă, dar o creștere limitată a activității lactazei, comparativ cu un grup netratat . Merită menționat faptul că un GFD strict este tratamentul de elecție nu numai pentru CD, ci și pentru deficiențele secundare de DS asociate CD .
2.3. Diagnosticul CD cu scorul Marsh I/II al biopsiilor mucoasei intestinului subțire (CD subclinică)
În biopsiile mucoasei intestinului subțire cu scor Marsh I și/sau II, nu există atrofie viloasă . Atrofia vilozitară cuprinde doar stadiul final în evoluția clinică a bolii; DC se dezvoltă treptat de la inflamația mucoasei intestinului subțire la hiperplazia criptelor și, în cele din urmă, la atrofia vilozitară .
Modificările biopsiilor mai ușoare care se limitează la infiltrarea limfocitară cu sau fără hiperplazie a criptelor pot necesita date suplimentare pentru a crește certitudinea unui diagnostic de DC, deoarece aceste modificări histologice nu sunt exclusive pentru DC . Diagnosticul de CD poate fi îmbunătățit prin genotipare (HLA-DQ2 sau HLA-DQ8); markerii serologici și colorarea imunohistochimică a limfocitelor intraepiteliale γδ+ve găsite la pacienții cu CD pot fi, de asemenea, utilizate pentru a confirma diagnosticul .
Deteriorarea microvililor poate fi una dintre cele mai timpurii modificări induse de gluten în CD . Prin urmare, modificările biochimice pot precede anomaliile histologice ale biopsiei duodenale observate prin microscopie optică . Murray et al. au raportat diagnosticul de CD la biopsia repetată la 4 din 37 (10,8%) de pacienți care nu prezentau atrofie vilozitară la biopsia inițială cu câțiva ani înainte. Cu toate acestea, acești patru pacienți aveau activități DS scăzute și modificări histologice minore (Marsh I sau II) în biopsia inițială. Activitățile DS reduse fără atrofie vilozitară pot reprezenta, prin urmare, CD precoce .
Mones et al. au observat o reducere marcată a activităților DS la pacienții pediatrici cu CD ale căror modificări histologice în biopsiile intestinului subțire au fost cotate ca Marsh I sau II (cu vilozități intacte). Un test pozitiv pentru prezicerea CD a fost definit prin următoarele valori limită pentru activitatea DS individuală: lactază, ≤15 unități/g proteină; zaharază, ≤25 unități/g proteină; maltază, ≤100 unități/g proteină; și palatinază, ≤5 unități/g proteină. Sensibilitatea diagnosticului a variat de la 74% la 85%, cu cea mai mare sensibilitate observată pentru lactază. Specificitatea diagnosticului a variat de la 57% la 91%, cu cea mai mare specificitate pentru sucrasă. Valoarea predictivă pozitivă a unui deficit de DS pentru a prezice CD a variat de la 70% la 91%. Valorile predictive negative (un nivel normal de DS) au variat de la 72% la 76% pentru a prezice o biopsie care nu este considerată a fi CD . Deficitul de DS constatat în biopsiile duodenale poate, prin urmare, să ajute la diagnosticul de DC în biopsiile cu vilozități intacte . O constatare similară a fost raportată într-un alt studiu în care evaluarea activităților DS a furnizat dovezi pentru a susține diagnosticul de DC la unii pacienți .
3. Aspecte de cercetare a activităților dizaharidazei în boala celiacă
Activitățile DS în biopsiile mucoasei intestinale mici pot fi determinate prin metoda Dahlqvist. Țesutul este incubat cu dizaharidul relevant, iar glucoza eliberată este determinată prin analiză colorimetrică cu ajutorul reactivului TRIS-glucooxidază. Unitățile de activitate DS sunt exprimate ca micromoli de dizaharidă hidrolizată pe minut pe gram de mucoasă (greutate umedă) .
3.1. Factori care afectează activitățile enzimatice
DS sunt reduse în boala celiacă activă. Ele pot fi reduse în alte afecțiuni, inclusiv în bolile inflamatorii intestinale, alergiile alimentare, dispepsia, malabsorbția proteino-energetică, imunodeficiențele și bolile infecțioase (cum ar fi giardioza, infecțiile virale și creșterea excesivă a bacteriilor din intestinul subțire) . Scăderea activităților DS poate fi, de obicei, inversată prin tratarea cu succes a bolii de bază. În mod interesant, DS poate fi, de asemenea, crescută în mod anormal la pacienții diabetici . O reducere a deficiențelor DS individuale este observată în cazul deficiențelor DS primare, care includ intoleranța congenitală la lactoză, deficitul de zaharază-izomaltază, deficitul de maltază-glucoamilază și deficitul de trehalază .
La persoanele sănătoase, activitățile DS pot prezenta o gamă largă de valori absolute . Există mai mulți factori endogeni și exogeni care afectează activitățile acestora.
3.1.1. Factori endogeni
Activitățile DS variază de-a lungul axei longitudinale (duoden-jejunum-ileum) a intestinului . Lactaza are activități maxime la 50-200 cm de ligamentul lui Treitz și este aproape absentă în ileonul distal. Activitățile sucrasei sunt constante de-a lungul intestinului subțire. Maltaza este de două ori mai abundentă în ileonul distal comparativ cu cea din jejunul proximal .
Etnicitatea afectează valorile DS, așa cum s-a demonstrat la compararea copiilor africani și finlandezi cu arhitectură viloasă normală; primii au avut activități mai scăzute de lactază duodenală, sucrasă și maltază. Aproximativ o treime dintre copiii finlandezi prezintă o activitate a lactazei sub intervalul de referință stabilit de 20 U/g de proteine, spre deosebire de două treimi dintre copiii africani .
Sexul nu afectează niciuna dintre activitățile DS . Vârsta are un efect semnificativ doar asupra activității lactazei; aceasta scade odată cu vârsta. La unii copii de culoare, deficitul de lactază se poate dezvolta după vârsta de 3 ani și nu este asociat cu boala mucoaselor .
Ritmul circadian influențează activitățile DS . În plus, oscilațiile activităților DS se corelează cu ritmul aportului alimentar .
Modificările mucoasei parcelare care pot apărea în DC afectează valorile absolute ale activităților DS găsite în biopsii. Jonsson și colab. au demonstrat că a existat un coeficient de variație de aproximativ 30% în activitatea DS a specimenelor prelevate din două situsuri din duoden.
3.1.2. Factori exogeni
Se știe că hrănirea cu zaharoză crește activitatea sucrase-izomaltazei. Această creștere este rezultatul sintezei de novo a enzimei care atinge vârful (creștere de 2,6 ori) la 12 ore după începerea unei diete care conține zaharoză . Degradarea enzimei este independentă de dietă .
Grășitul împiedică reînnoirea celulelor epiteliale intestinale. Determină o reducere a masei intestinului subțire, a dimensiunii vilozităților și a indicelui mitotic al enterocitelor din cripte. Privarea de carbohidrați induce o scădere a zaharazei intestinale care este restabilită prin hrănirea cu carbohidrați .
Nivelurile DS variază, de asemenea, în funcție de locul biopsiei . Acest lucru este valabil nu numai pentru axa longitudinală (duodenum-jejunum-ileum) din intestinul subțire, ci și pentru axa cripto-villoasă. Deoarece DS sunt încorporate în microvillii ale enterocitelor viloase, activitatea lor depinde de numărul de enterocite viloase prezente în biopsie , astfel încât biopsiile mai superficiale care au un conținut mai mare de epiteliu ar putea avea un conținut mai mare de DS.
3.2. Metode ex vivo și in vitro pentru studierea toxicității glutenului în boala celiacă
Nu există un model animal care să reproducă toate caracteristicile bolii celiace . Testarea in vivo este standardul de aur pentru evaluarea toxicității celiace . Cu toate acestea, este bine stabilit faptul că administrarea in vivo de gluten poate provoca leziuni sistemice la pacient. Prin urmare, metodele in vitro sunt de obicei utilizate înainte de a se efectua studii in vivo atunci când se evaluează produsele alimentare pentru lipsa toxicității CD .
Cea mai fiabilă metodă in vitro este cultura de biopsie a mucoasei intestinului subțire, adesea denumită cultură de organ de biopsie duodenală (OC). Metoda a fost descrisă inițial de Browning și Trier . Există o cerință semnificativă pentru studiile preclinice in vitro, astfel încât principiul metodei lui Browning și Trier a fost dezvoltat în continuare și aplicat la testarea probioticelor care necesită o stimulare apicală a explantelor de mucoasă intestinală . OC permite diverse alte aplicații, de exemplu, studii biochimice de sinteză și procesare a DS , asamblarea dimerică a DS și studierea efectelor insulinei asupra activităților ridicate ale DS la subiecții diabetici .
Metoda originală a lui Browning și Trier a fost modificată astfel încât sistemul să detecteze efectele nocive ale glutenului prin adăugarea acestuia în mediul de cultură și evaluarea anomaliilor histologice, morfologice și imunologice ulterioare. Tehnica modificată a lui Browning și Trier este încă utilizată pe scară largă în studiile care examinează patogeneza CD și în testarea toxicității celiace . Sistemul OC s-a dovedit a fi, de asemenea, util pentru a ajuta la diagnosticarea CD, în principal în cazurile fără atrofie viloasă sau la pacienții seronegativi .
3.2.1. Lucrări timpurii privind cultura de organe ale intestinului subțire și studiul enzimelor de la marginea periei în CD
Deteriorarea enterocitelor este semnul distinctiv al bolii celiace . Efectul toxic al glutenului asupra mucoasei intestinului subțire a fost demonstrat din punct de vedere biochimic prin măsurarea activității fosfatazei alcaline (PA), enzima de la marginea periei, în CO. Activitatea PA obținută din biopsii ale pacienților cu CD netratați a crescut atunci când țesutul a fost incubat în mediu fără gluten. Această creștere a fost inhibată de prezența peptidelor de gluten în mediul de cultură, demonstrând efectele toxice ale glutenului .
Katz și Falchuk au propus ulterior utilizarea tehnicii OC la nivelul intestinului subțire ca test predictiv pentru diagnosticul definitiv de sensibilitate la gluten. Douăzeci și doi din 26 de pacienți diagnosticați cu CD au prezentat sensibilitate la gluten in vitro la biopsiile lor inițiale. O creștere a activității PA a țesutului intestinal de la acești 22 de pacienți a fost inhibată de prezența peptidelor de gluten în mediu. Rata fals-negativă pentru stabilirea diagnosticului de CD a fost, prin urmare, de 15% (4 din 26). În studiul lor, au existat, de asemenea, 14 pacienți cu mucoase anormale care s-au dovedit a nu avea DC. Treisprezece dintre ei nu au prezentat sensibilitate la gluten in vitro (o rată fals-pozitivă de 7%). Toți pacienții cu biopsii normale au fost clasificați corect. Aceste rezultate interesante au sugerat că cultura de organe ale intestinului subțire ar putea fi utilizată pentru diagnosticul prospectiv al CD. Într-un alt studiu, Falchuk et al. au demonstrat din nou sensibilitatea la gluten in vitro la pacienții cu CD activă. Ei au sugerat, de asemenea, că existau diferențe în funcție de tipul de histocompatibilitate al subiecților.
Alți cercetători au întreprins studii similare de CO, măsurând activitatea PA și o altă enzimă de la marginea periei α-glucozidază. Howdle et al. și Hauri et al. nu au putut reproduce efectele in vitro ale glutenului asupra biopsiilor duodenale de la pacienți cu CD netratați și nici prin evaluarea activității AP sau α-glucozidazei.
Mitchell et al. au arătat că există o pierdere progresivă de proteine din țesut în timpul OC. În același timp, nivelurile enzimelor de la marginea periei scad și se acumulează în mediu. Prin urmare, ei au sugerat exprimarea activităților enzimatice ca mU/ml de mediu de cultură, spre deosebire de U/g de proteină, din cauza pierderilor de proteine în timpul cultivării organului și a activităților enzimatice recuperate în mediu .
Diferiți autori au investigat proteinele, conținutul de ADN și enzimele de la marginea perilor în OC din biopsia intestinului subțire. Cei mai mulți au observat o scădere a tuturor acestor parametri în biopsiile cultivate, cu excepția activității PA care a crescut practic în toate cazurile . DS se pierd probabil mai ușor în mediu în timpul culturii decât AP .
3.2.2. Modele celulare și activități enzimatice
În plus față de OC din mucoasa intestinului subțire a pacienților cu CD, cercetătorii au folosit diferite linii celulare pentru studii in vitro ale CD. Modelele celulare consacrate se bazează pe liniile de celule T sensibile la gluten și pe clonele izolate de la persoane cu CD, care sunt încă utilizate pe scară largă în screeningul pentru toxicitatea CD . O cantitate semnificativă de cercetări a fost întreprinsă, de asemenea, folosind linii celulare epiteliale de origine canceroasă, care sunt relativ ușor de cultivat. Cu toate acestea, nu s-a stabilit în ce măsură transformarea malignă afectează posibila lor dependență de influențele micro-mediului înconjurător. S-a demonstrat că, spre deosebire de celulele epiteliale normale, liniile celulare de cancer de colon nu necesită adăugarea de factori de creștere pentru extinderea lor in vitro . În plus, celulele Caco2 exprimă cantități considerabil mai mici de enzime de graniță perie în comparație cu enterocitele normale .
Până când Sato și colab. au publicat descoperirea lor revoluționară privind organoizii intestinali, enterocitele erau în mod notoriu dificil de crescut in vitro. De-a lungul deceniilor, multe studii privind epiteliul intestinal normal au raportat dificultăți în menținerea culturii acestor celule pentru mai mult de câteva zile ( și referințe în acest sens), în ciuda utilizării diferitelor protocoale de izolare și a condițiilor de cultură ulterioare. Timp de mulți ani s-a crezut că culturile pe termen lung din țesuturi umane primare nu pot fi stabilite decât dacă celulele au fost transformate genetic. S-a descoperit, de asemenea, că întreruperea interacțiunilor dintre celulele epiteliale normale și matricea extracelulară înconjurătoare induce apoptoza celulelor .
Quaroni și colab. , cu toate acestea, au reușit să stabilească o cultură pe termen lung de celule epiteliale ale intestinului subțire de șobolan. Abordarea lor inițială pentru izolare a fost cea utilizată în OC, dar celulele epiteliale cultivate aveau caracteristicile celulelor nediferențiate din cripta intestinului subțire. Niveluri slabe de diferențiere a enterocitelor cultivate in vitro au fost raportate în alte studii care au utilizat biopsii intestinale umane, de șoarece, de șobolan și de bovină, care sunt în concordanță cu observațiile noastre (date nepublicate). Rusu et al. au studiat diferențierea in vitro prin evaluarea activităților specifice ale maltazei și AP în probe de bovine din (a) epitelii proaspăt răzuite, (b) suspensii organoide utilizate pentru însămânțarea culturilor (a nu se confunda cu organoidele lui Sato) și (c) culturi de celule intestinale care includ celule cultivate primar și celule cultivate după primul și al doilea pasaj. Suspensiile organoide au prezentat o reducere de 50 % în raport cu preparatul de epiteliu proaspăt. Activitatea maltazei, utilizată ca marker de diferențiere, a scăzut în mod clar în culturile primare și odată cu trecerile ulterioare ale culturii spre un nivel scăzut stabil. Rezultate similare au fost obținute din măsurătorile activității AP intestinale. Aceste rezultate au reflectat o pierdere a diferențierii celulare in vitro .
Epiteliul este doar una (i) din cele patru componente ale unei unități funcționale integrate care constă, de asemenea, din (ii) matrice extracelulară, (iii) celule derivate din mezenchim și (iv) factori luminali. Izolarea enterocitelor de mediul lor mezenchimal duce la pierderea diferențierii . Celulele de intestin subțire fetale umane netransformate cultivate pe plastic prezintă caracteristicile enterocitelor de criptă nediferențiate . Adăugarea secvențială de molecule de țesut conjunctiv și de molecule luminale la enterocitele fetale umane nemaligne in vitro a indus un spectru de modificări ale tipului de celule epiteliale în direcția diferențierii complete . O linie celulară de intestin subțire de șobolan s-a diferențiat, de asemenea, după cum a fost evaluat printr-o creștere semnificativă a activității zaharazei, atunci când a fost cultivată în prezența mezenchimului . Dezvoltarea și diferențierea normală a epiteliului intestinului subțire depinde, prin urmare, de interacțiunea cu mezenchimul și cu alți constituenți .
Culturile pe termen lung de celule epiteliale umane primare normale izolate din intestinul subțire sunt acum bine stabilite. „Mini-intestinele” epiteliale umane pot fi cultivate din cripte intestinale și celule stem unice . Este posibilă propagarea in vitro a culturilor organoide care provin atât din intestinul de șoarece, cât și din cel uman. Aceste organoide pot fi cultivate pe termen nedefinit și prezintă toate caracteristicile epiteliului intestinului subțire în ceea ce privește arhitectura, tipurile de celule și caracteristicile de auto-reînnoire .
Sato et al. au definit condițiile care au favorizat proliferarea și diferențierea organoidelor. Celulele stem, precum și organoidele trebuiau să fie încorporate în Matrigel, care este o matrice bogată în laminină și colagen care imită lamina bazală. Cultura intestinului subțire uman este mai complexă decât cea a intestinului de șoarece. În plus față de R-spondină, Noggin și factorul de creștere epidermică, condițiile de cultură optimizate pentru omul uman necesită mai multe suplimente (Wnt3A, gastrină, nicotinamidă, inhibitor de Alk și inhibitor de p38). Diferențierea organoizilor epiteliali mici umani cultivați în diferite tipuri de celule ale intestinului necesită retragerea anumitor suplimente (Wnt3, nicotinamidă și inhibitor de p38). Un marker de diferențiere pentru enterocitele mature a fost vizualizat prin colorația AP a frontierei perii . Într-un alt studiu, Middendorp et al. au omis, de asemenea, anumite suplimente de cultură pentru a obține diferențierea intestinului subțire a organoizilor umani. Cu toate acestea, este interesant faptul că vizualizarea enterocitelor mature prin colorarea cu sucrase-izomaltază a funcționat bine pentru organoidele ileale, dar nu și pentru cele duodenale. Expresia lactazei a fost indusă atât în organoidele ileale, cât și în cele duodenale de așa-numitul mediu de diferențiere .
3.2.3. Progrese recente în metodele organoidale intestinale
Tehnologia organoidală ar putea avea aplicații în terapia regenerativă pentru unele boli intestinale prin expansiunea ex vivo a epiteliilor intestinale și transplant . Această metodologie permite, de asemenea, propagarea in vitro a țesuturilor gastrointestinale bolnave care ar putea elucida patogeneza bolii și dezvoltarea de terapii . Organoizii intestinali au fost deja utilizați pentru a modela boli monogenice care afectează epiteliul, boli inflamatorii intestinale (analizând moartea celulară, integritatea mucoasei și efectele citokinelor inflamatorii) și interacțiunile dintre țesuturile intestinale și microbi, precum și cancerul ( și referințe în acest sens). Cercetarea în domeniul CD rămâne în urma acestor progrese. Este bine stabilit faptul că există multe tipuri de celule implicate în patogeneza CD și, ca atare, organoizilor le lipsesc multe dintre tipurile celulare prezente într-un sistem in vivo. Cu toate acestea, complexitatea poate fi crescută prin cocultură cu celule imune . Nozaki et al. au descris cocultura de organoide murine și limfocite intraepiteliale (IEL) în care atât celulele αβT, cât și γδT au proliferat cu succes și au fost la fel de mobile ca și IEL-urile rezidente în medii in vivo. Coculturi de organoizi au fost descrise, de asemenea, pentru sistemul nervos enteric și miofibroblaste .
Datorită progreselor în testarea serologică și genetică în diagnosticarea bolii celiace, biopsia duodenală ar putea să nu mai fie necesară pentru mulți pacienți. Prin urmare, materialul de biopsie va deveni rar. Cu toate acestea, organoidele intestinale pot fi, de asemenea, generate din celule stem embrionare sau din celule stem pluripotente induse ( și referințe în acest sens) care, deși necesită mai mult timp pentru a fi create și sunt mai solicitante și mai costisitoare din punct de vedere tehnic, spre deosebire de organoidele derivate din biopsie, pot crește foarte mult numărul de organoide rezultate și pot permite ca materialul clinic să fie utilizat în schimb pentru creșterea celulelor imune.
3.2.4. Relevanța activității organoizilor intestinali și a enzimelor de la marginea periei pentru dezvoltarea unor metode in vitro de ultimă generație pentru cercetarea CD
Este bine stabilit faptul că răspunsurile imune înnăscute și adaptative sunt declanșate în patogeneza CD ; cu toate acestea, secvența exactă a acestor evenimente patologice nu a fost elucidată până în prezent. Cu toate acestea, tehnologia organoidală permite adăugarea secvențială a celulelor în cocultură, permițând astfel studierea răspunsului imunitar înnăscut prin reconstituirea organoizilor celiaci și a IEL-urilor separat de efectele unui răspuns imunitar adaptativ. La rândul lor, celulele T specifice glutenului, care pot fi, de asemenea, cultivate in vitro, pot fi apoi incluse în acest model in vitro de CD pentru a facilita evaluarea completă a efectelor toxice ale glutenului asupra epiteliului intestinal.
Tehnologia organoidală permite, de asemenea, elucidarea rolului enterocitelor în procesarea peptidelor de gliadină în CD. Enterocitele au capacitatea de a funcționa ca celule prezentatoare de antigen, prin care stimularea celulelor T este mediată de moleculele lor HLA-DR . În plus, gliadina conține peptide care pot declanșa răspunsul imunitar înnăscut . Este interesant faptul că peptidele de gluten care declanșează imunitatea înnăscută în boala celiacă sunt procesate diferit în cadrul enterocitelor, în comparație cu cele care declanșează un răspuns imun adaptativ, în care peptidele ajung la endosomii tardivi HLA-DR pozitivi și sunt prezentate celulelor T din lamina proprie . Având în vedere că deteriorarea marginii în perie a enterocitelor este una dintre cele mai timpurii alterări ale CD, DS ar putea fi utilizată pentru a studia efectele toxice ale glutenului în CD. Este important de remarcat faptul că enzimele de la marginea periei fac parte integrantă din enterocitele vilozitare mature și sunt asociate cantitativ cu diferențierea acestora . Cu toate acestea, este posibil ca activitatea DS să nu fie corelată cu viabilitatea enterocitelor, deoarece activitățile enzimelor de la marginea periei au fost demonstrate în celulele epiteliale neviabile . Prin urmare, imunocolorația sau, mai precis, lipsa imunocolorației pentru enzimele de la marginea periei datorată distrugerii microvililor, mai degrabă decât a activităților acestora, ar putea fi utilizată ca marker al patogenezei CD.
Tehnologia organoidală are un potențial substanțial pentru modelarea bolii și, prin urmare, pentru elucidarea secvenței de evenimente patogene în CD în care pot fi utilizate enzimele de la marginea periei. Noile modele in vitro bazate pe progresele recente în cercetarea celulelor stem pot facilita dezvoltarea de noi strategii terapeutice în DC.
4. Concluzii
Structura mucoasei intestinului subțire și procesele fiziologice implicate sunt foarte complexe. CD crește această complexitate, afectând multe componente ale intestinului, inclusiv DS. În ciuda faptului că activitățile DS au jucat un rol important în ajutarea diagnosticului de DC, aplicarea activităților DS la cercetarea in vitro în DC rămâne de stabilit. Progresele recente în creșterea ex vivo a „mini-intestinelor” epiteliale oferă o nouă platformă interesantă care a devenit disponibilă. Aceasta permite aplicații pentru a studia epiteliul normal sau bolnav cu ajutorul ingineriei tisulare. Celulele epiteliale cresc și se diferențiază în condiții definite care includ prezența unei matrice extracelulare și a unor factori de creștere. O populație de celule epiteliale care se reînnoiesc singure exprimă enzimele de la marginea periei, care ar putea fi utilizate în studiile in vitro ale CD atunci când există o reconstituire a altor celule imune în model.
Conflicte de interese
Autorii declară că nu au conflicte de interese.
Recunoștințe
Autorii doresc să mulțumească Dr. H. Julia Ellis pentru discuțiile utile și pentru revizuirea manuscrisului. Tanja Šuligoj ar dori să mulțumească Clinical Research Trust pentru sprijin. Borut Božič ar dori să mulțumească pentru sprijinul financiar parțial acordat de Fundația Slovenă pentru Știință, Grant nr. SZF-BBozic01/2007.