I.U.B.B.: 3.1.27.5
C.A.S.: 9001-99-4
Enzymatisk reaktion (billedet åbner i et nyt vindue)
Pancreatisk ribonuklease (RNase) er en endoribonuklease. Den katalyserer spaltningen af fosfodiesterbindingen mellem 5′-ribose af et nukleotid og fosfatgruppen, der er knyttet til 3′-ribose af et tilstødende pyrimidinnukleotid. Denne spaltning danner et 2′,3′-cyklisk fosfat, som derefter hydrolyseres til det tilsvarende 3′-nukleosidfosfat.
RNase findes i størst mængde i pancrease fra drøvtyggere (Barnard 1969). Den vigtigste komponent i det krystallinske enzym er RNase A; en mindre komponent er RNase B. RNase B er den glykosylerede form af RNase A (Beintema et al. 1976).
Historie:
Jones’ arbejde i 1920 nævnes normalt som “begyndelsen” af pancreatisk ribonuklease (Richards og Wycoff 1971). RNase blev isoleret af Dubos og Thompson i 1938 og krystalliseret af Kunitz i 1940.
I 1947 var Worthington det første firma, der fremstillede højt oprenset krystallinsk RNase. I begyndelsen af 1950’erne fremstillede firmaet Armour råkrystallinsk enzym og tilbød det til en meget overkommelig pris. I 1960’erne og 1970’erne var RNase A en favorit til undersøgelse, først og fremmest fordi det er bemærkelsesværdigt termostabilt og findes i høj koncentration i en tilgængelig kilde, nemlig bovin bugspytkirtel. Disse undersøgelser førte til opklaring af krystalstrukturen (Anfinsen 1959, Groves 1966 og Scheraga 1967), bestemmelse af aminosyresekvensen (Smyth et al. 1963), identifikation af den katalytiske mekanisme (Beers 1960) og afklaring af foldningsvejene (Hantgan et al. 1974). RNase A var det første enzym og det tredje protein, for hvilket der blev fastlagt en korrekt aminosyresekvens (Raines 1998).
Fire nobelpriser er blevet tildelt for arbejde i forbindelse med studier af RNase (Anfinsen, Moore, Stein og Merrifield). Den omfattende litteratur og de mange undersøgelser har gjort RNase til det 20. århundredes mest omfattende undersøgte enzym (Raines 1998).
Det seneste arbejde fortsætter med at undersøge syntesen og modningen af RNase i det endoplasmatiske retikulum i levende celler (Geiger et al. 2010). Der arbejdes også stadig meget på at studere foldning og aggregering af RNase (Benito et al. 2008, Iwaoka et al. 2008, og Arai et al. 2010). Enzymets rolle i kræftudvikling og genregulering undersøges (Shlyakhovenko 2009), og det er ved at blive udviklet til kemoterapeutiske midler mod kræft (Chao et al. 2010).
Specificitet:
RNase A er specifik for pyrimidinnukleosidbindinger (Volkin og Cohn 1953). Reaktionen menes at foregå i to trin. I det første trin spaltes 3′,5′-phosphodiesterbindingen, idet der dannes et 2′,3′-cyklisk phosphodiesterintermediat. I andet trin hydrolyseres den cykliske phosphodiester til en 3′-monofosfatgruppe. Det første trin er uspecifikt med hensyn til substratets nitrogenbase; det andet trin er imidlertid helt specifikt for pyrimidinnukleotider med terminale 2′,3′-cykliske phosphater. RNase B har den samme specificitet som RNase A over for både cyklisk cytidylat og gær-RNA (Plummer og Hirs 1963). RNase A viser en præference for større substrater (Nogués et al. 1995).
Enzymet spalter ved cytidinrester dobbelt så hurtigt som ved uridylrester (Richards og Wyckoff 1971). Thr45 har vist sig at være vigtigst for formidlingen af pyrimidinspecificiteten, både ved at danne hydrogenbindinger med pyrimidinbaser og ved sterisk at udelukke purinbaser (del Cardayré og Raines 1994). Asp83’s sidekæde er vigtig for stabilisering af overgangstilstanden under spaltning af uridinholdige substrater; denne rest har ingen effekt på kinetikken af cytidin-spaltning (del Cardayré og Raines 1995).
Sammensætning:
Proteinets form ligner en nyre, med de aktive site-rester liggende i spalten (Richardson 1981, og Raines 1998). Sekundærstrukturen indeholder lange firestrengede antiparallelle beta-sheets og tre korte alpha-helices (Raines 1998). RNase A indeholder fire disulfidbindinger, som er afgørende for stabiliteten af det native enzym. To af disse disulfidbindinger ligger mellem en alfa-helix og et beta-sheet og bidrager mere til den termiske stabilitet end de to andre (Klink et al. 2000). RNase B er et glykoprotein, der ved Asn34 indeholder et enkelt oligosakkarid bestående af seks rester mannose og to rester N-acetylglucosamin (Tarentino et al. 1970).
Molekylære karakteristika:
RNase A er et lille protein, idet det modne enzym kun har 124 aminosyrerester, uden at der er knyttet kulhydrat. RNase A indeholder 19 af de 20 aminosyrer og mangler kun tryptofan (Nogués et al. 1995, og Raines 1998). RNase A’s tredimensionelle struktur er fuldt ud kodet af dens aminosyresekvens (White og Anfinsen 1959, og Raines 1998). Alle otte menneskelige RNase A-lignende gener er placeret på kromosom 14. De koder hver især for en sekretorisk signalsekvens og indeholder en invariant katalytisk triade af to histidiner og en lysin med et konserveret motiv (CKXXNTF) (Marshall et al. 2008).
Aminosyresekvenserne af mange RNase A homologer er blevet identificeret, hvilket gør RNase A til et modelsystem for hvirveldyrs molekylære evolution (Dyer og Rosenberg 2006). Ud fra sekvenserne og deres fordeling over en række arter er det blevet fastslået, at RNase A er et moderne protein, der udvikler sig hurtigt (Doolittle 1992, og Raines 1998).
Proteinaccessionsnummer: P61823
CATH-klassifikation (v. 3.2.0):
- Class: Alpha-Beta
- Arkitektur: Alpha-Beta
- Arkitektur: Roll
- Topologi: P-30 Protein
Molekylvægt:
- RNase A: 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNase B: 14,700 ± 0,3 (Plummer og Hirs 1963)
Optimal pH:
Optimal pH: RNase A: 7,0-7,5 (Brown og Todd 1955)
Isoelektrisk punkt: RNase A: 7,0-7,5 (Brown og Todd 1955)
Isoelektrisk punkt:
- RNase A: 9,3 (Ui 1971)
Extinktionskoefficient:
- RNase A og B: 8.640 cm-1M-1 (Teoretisk)
- RNase A: E 1%, 280 = 7,3 (Worthington RNase A)
- RNase B: E 1%, 280 = 5.77 (Teoretisk, RNase B)
Active Site Residues:
- Histidin (H12, H119)
- Lysin (K41)
Aktivatorer:
- Natriumklorid (Weickmann et al. 1981)
- Sulfat (Moosavi-Movahedi et al. 2006)
Inhibitorer:
- Sværmetalioner
- Ribonukleaseinhibitor (RI), et 50 kDa protein, der udgør ≤ 0.01% af proteinet i cytosolen i pattedyrceller (Takahashi 1967)
- Uridin-vanadatkomplekser (Lindquist et al. 1973)
Anvendelser:
- RNA-fjernelse under DNA-isolering
- RNA-sekvensanalyse
- RNase-beskyttelsesassays
- RNA-kvantificering eller kortlægning
- RNA-rensning af plasmid-DNA
- Genomisk DNA-isolering
- Molekylvægtmarkør