7 RAG-binding Genomewide
I betragtning af RAG1’s direkte DNA-bindende egenskaber, kombineret med den unikke overflod af RSS’er i antigenreceptorgenerne, var det rimeligt at antage, at V(D)J-rekombinationens stedsspecificitet simpelthen forstærkes af RAG1’s rekruttering til sine foretrukne DNA-substrater. RAG2 burde på grund af sin PHD og sin mangel på iboende katalytisk aktivitet ikke udvise nogen funktionelle begrænsninger for sine lokaliseringsmønstre. Følgelig binder RAG2 bredt på tværs af lymfocytgenomet og besætter en større fraktion (~ 60%) af de aktive TSS’er, som er beriget i H3K4me3 (Ji et al., 2010; Teng et al., 2015). RAG1 lokaliserer imidlertid også til tusindvis af steder (~ 3500 i musethymocytter og pre-B-celler), der er co-besat af RAG2 og H3K4me3, hvilket omfatter en væsentlig del af meget aktive, lineage-specifikke promotorer og enhancere (Teng et al., 2015). Denne udbredte lokalisering er også observeret for en katalytisk mutant af RAG1 (D708A), hvilket indikerer, at den udbredte binding af RAG1 ikke afspejler postcleavage akkumulation (Teng et al., 2015). RAG1-bindingsstederne uden for antigenreceptorgener viste ingen klar korrelation med tilstedeværelsen af RSS-lignende motiver (kryptiske RSS’er eller cRSS’er), hvilket yderligere indikerer, at sekvensspecifikke kontakter og RAG-medieret spaltningsaktivitet ikke kunne forklare mønstre af RAG1-binding i hele genomet. I stedet er markører af kromatintilgængelighed de bedste forudsigere af RAG1-rekruttering: H3K4me3, H3K27Ac, forhøjet GC-indhold og forhøjet CpG-indhold (Teng et al., 2015).
Faktisk er der kun en håndfuld eksempler, der viser specifik RAG1-rekruttering til antigenreceptorgener via trans-faktorer, der interagerer med både RAG1 og specifikke DNA-motiver. I hvert enkelt tilfælde afhænger rekrutteringsbegivenhedens locusspecificitet ikke af RSS’en i sig selv, men af et transkriptionsfaktorbindingsmotiv, der tilfældigvis overlapper med en RSS. Musens Tcrb-lokus illustrerer et tilfælde, hvor målrettet RAG1-rekruttering bidrager til “beyond 12/23”-restriktioner, der hjælper med at opretholde den korrekte rekombinationsrækkefølge (Dβ-Jβ før Vβ-DJβ). De 3′ 23-RSS’er, der flankerer Dβ1 og Dβ2, indeholder konserverede bindingssteder for c-fos, en underenhed af AP-1-transskriptionsfaktoren (Wang et al., 2008). På en måde, der er uafhængig af dens transkriptionelle aktiverende egenskaber, rekrutterer c-fos fortrinsvis RAG1 til 3′ Dβ RSS’erne og favoriserer således Dβ-Jβ-rekombination (Wang et al., 2008). I B-linjen er det analoge antigenreceptorlokus Igh-genet, hvor direkte Vh-Dh-rekombination er ugunstigt stillet i forhold til Vh-DJh-rekombination. I dette tilfælde synes rekombinationsrækkefølgen imidlertid at være reguleret af lokale forskydninger i epigenetiske mærker, der følger D-Jh-rekombination og markerer DJ-produktet til fortrinsvis RAG1-binding og rekombination i forhold til germline Dh-gen-segmenter (Subrahmanyam et al., 2012). Desuden undertrykkes direkte Vh-Dh-rekombination af et sekvenselement kendt som IGCR1, der ligger mellem D- og V-genklyngerne (Guo et al., 2011). IGCR1 indeholder to vitale CTCF-steder og menes at fungere som et ankerpunkt for kromatinsløjfer, der isolerer DJ-delen af Igh-lokusset fra V-delen (Guo et al., 2011; Lin, Guo, Su, Su, Zhang, & Alt, 2015; Medvedovic et al., 2013). Det menneskelige Tcrd-lokus giver et andet eksempel på lokusspecifik RAG1-deponering, hvor Runx1-afhængig RAG1-rekruttering til Dδ2 favoriserer en Dδ2-Dδ3-omlægningsbegivenhed, der går forud for klassisk Dδ-Jδ-rekombination (Cieslak et al., 2014). Dette resulterer i human-specifik inklusion af to D-gen-segmenter i Tcrd-rearrangementer. Endelig er Pax5 blevet foreslået at interagere med RAG og lette RAG-rekruttering til Vh-gen-segmenter (Zhang et al., 2006), selv om det endnu ikke er blevet vist, at denne mekanisme forbedrer endogen Igh locus samling.
Udover disse undtagelser synes RAG1-binding ikke primært at initiere fra sekvensspecifikke rekrutteringsbegivenheder. Selv inden for Tcr- og Ig-generne strækker RAG1-binding sig ud over RSS-grænserne og besætter introniske regioner, der er beriget i H3K4me3, men blottet for RSS’er (Teng et al., 2015). Dette betyder ikke, at RSS’erne ikke spiller sekundære roller i stabilisering eller forbedring af RAG1-binding efter rekruttering. Tcra- og Igk-generne er de bedste rekruttere af RAG1-binding i henholdsvis dobbelt-positive thymocytter og pre-B-celler, og definerede toppe af RAG1-akkumulering observeres tydeligt over RSS’erne i rekombinationscentre (Teng et al., 2015). Den ekstraordinære tæthed af RSS’er i antigenreceptorgenerne er sandsynligvis et af de vigtigere kendetegn, der adskiller dem fra resten af genomet.
Genomet generelt udviser imidlertid RSS-uafhængig RAG1-rekruttering, som sandsynligvis sker gennem uspecifikke interaktioner mellem RAG1 og DNA, der medieres af forskellige domæner i RAG1-kernen, herunder NBD (Teng et al., 2015; Yin et al., 2009). Desuden kan indirekte rekruttering af RAG1 til kromatin forekomme gennem dets interaktion med RAG2, selv om sidstnævnte ikke fuldt ud kan redegøre for RAG1-bindingsmønstre, som delvist opretholdes i fravær af RAG2, om end med nedsat intensitet (Teng et al., 2015).
Den genomiske rækkevidde af RAG1-bindingssteder, selv om den er bredere end forudsagt, udvider sig endnu mere i fravær af ikke-kernedomæner af enten RAG1 eller RAG2. I fravær af RAG2’s C-terminale region (som omfatter PHD) diffunderer RAG1 mod steder med lavere tætheder af H3K4me3, snarere end at homing til de mest aktive TSS’er (Teng et al., 2015). En mulighed er, at dette skyldes en afmaskering af yderligere uspecifikke DNA-bindingsaktiviteter af RAG1, i betragtning af fraværet af det autoinhibitoriske domæne, der ligger i RAG2’s C-terminale region (Lu et al., 2015). En anden mulighed er, at i fraværet af RAG2 PHD-domænet fra RAG2 har RAG-komplekset mindre tilbøjelighed til at hjemtage regioner med højt H3K4me3. Det kan også være relevant for det bredere RAG1-bindingsmønster, at deletion af den C-terminale RAG2-region fører til opregulering af RAG1-proteinniveauet (Teng et al., 2015). Core RAG1 binder også meget mere promiskuøst end fuld længde RAG1, og interessant nok udviser en forhøjet intensitet af binding på mange ikke-antigenreceptorsteder, men nedsat intensitet på Tcra locus, i forhold til fuld længde RAG1(Teng et al., 2015). Dette kan afspejle ændringer i de iboende DNA-bindingsegenskaber af det trunkerede RAG1-protein eller fraværet af aktiviteter, der er kodet i RAG1’s noncore-terminaler (såsom RING-medieret histon-ubiquitylering eller C-terminal-medieret autoinhibition). Det kan også være relevant, at det faktum, der er nævnt ovenfor, at core RAG1 udtrykkes på væsentligt højere niveauer end fuld længde RAG1.
RAG-rekombinasen tolererer sekvensvariation ikke kun i sine substrater, især i RSS-spaceren, men også i heptameren og nonameren (Hesse et al, 1989; Lewis, Agard, Suh, & Czyzyk, 1997; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994; Zhang & Swanson, 2008). Selv RAG1-nonamer-interaktionen, der formidles af NBD’en, er afhængig af relativt få sekvensspecifikke kontakter (Yin et al., 2009). De RSS’er, der befolker antigenreceptorgenerne, er forskellige i deres sekvensindhold (nogle gange afviger de betydeligt fra konsensus heptamer- og nonamer-motiver), og RAG’s substratgenkendelse skal være tilstrækkelig fleksibel for at muliggøre maksimal repertoirediversitet. Uden for antigenreceptorgenerne viser RAG1-bindingsstederne ingen kumulativ præference for en bestemt sekvenssignatur (Teng et al., 2015).
Fleksibel substratgenkendelse af RAG skaber imidlertid et problem for resten af genomet. De ret minimale sekvenskrav til en funktionel RSS (i det mindste efter de regler, som vi i øjeblikket forstår) gør det muligt for cRSS’er at forekomme ret hyppigt i hvirveldyrgenomer (Lewis et al., 1997). Faren ved tilfældige cRSS’er bliver tydeliggjort af deres deltagelse i RAG-afhængige genetiske omlægninger, der bidrager til lymfomagenese (Larmonie et al., 2013). Da størstedelen af RAG1-bindingen i hele genomet er styret af uspecifik rekruttering til DNA eller tilgængeligt kromatin, synes det biologisk klogt at begrænse tilgængeligheden af stærke cRSS’er i nærheden af RAG1-bindingssteder og dermed minimere potentialet for off-target RAG-aktivitet. Faktisk er RAG1-bindingssteder i muselymfocytter og humane lymfocytter fortrinsvis udtømt for cRSS’er (Teng et al., 2015), og vi foreslår, at dette er sket på grund af selektivt pres på grund af genetiske omlægninger, der forekommer uden for antigenreceptorgenererne. Repertoiret af RAG1-associerede TSS’er er således beskyttet mod RAG-aktivitet under V(D)J-rekombination. Vi spekulerer, at de sjældne cRSSs, der bevarer aktivitet og fortsat formidler sjældne ektopiske rearrangementer, er blevet bevaret i genomet på grund af deres overlapning med regulatoriske eller funktionelle sekvenser i deres værtsloci, eller simpelthen ikke har udøvet tilstrækkeligt stærke negative konsekvenser til at blive selekteret imod.