Um papel crítico do CD29 e CD49f na mediação de metástases para células cancerígenas – células isoladas a partir de um modelo de rato associado a Brca1modelo de rato associado de cancro da mama

CSCs em células Brca1-mutante do cancro mediam a migração celular in vitro

Temos células CD24+CD29+ previamente isoladas e células CD24+CD49f+ que são enriquecidas para células iniciadoras de cancro ou CSCs de tumores mamários primários desenvolvidos em ratos Brca1-mutante ou de uma linha celular cultivada, (W0069), que foi derivada de um tumor mamário Brca1.39 Para testar o papel destas células na metástase, separamos as células CD24+CD29+ (devem ser chamadas CSCs) e CD24-CD29- células (não CSCs) da linha de células W0069 que contêm cerca de 15% de células CD24+CD29+, como mostrado anteriormente,39 e investigamos a capacidade de migração utilizando tanto o ensaio de cicatrização de feridas como o ensaio de transswell. Após 24 h, as células CD24/CD29 duplamente positivas demonstraram uma melhor capacidade de migração em comparação com as células duplamente negativas, conforme revelado pelo tamanho da ferida (Figura 1a). O ensaio de migração transwell também revelou uma diferença significativa no número de células migradas tanto na superfície inferior do filtro (175,6±19 vs 54,2±18,1, **P<0,01) como na câmara inferior do transwell (82,3±5,5 vs 4,3±2,1 colónias, **P<0,01) (Figura 1b). Resultados similares foram obtidos quando investigamos diferentes subclones derivados da mesma linha celular, sejam positivos ou negativos para a presença de CSCs (dados não mostrados). A fim de confirmar que os CSCs têm aumentado a motilidade, misturamos diferentes quantidades de células W0069 com células duplamente negativas classificadas a partir da linha de células W0069. Como mostrado na Figura 1c, a capacidade de migração diminuiu com a diminuição do número de células duplo-positivas, embora o número total de células utilizadas tenha permanecido estável, aumentando o número de células CD24-CD29-. Começando com 5 × 104 células W0069, encontramos que as células migradas formaram 52,6±15,5 colônias na câmara inferior. Quando 4 × 104 W0069 células foram misturadas com 1 × 104 células duplamente negativas, o número de colônias foi reduzido para 16±2,6. O número de colônias diminuiu ainda mais quando continuamos diminuindo o número de células W0069 e aumentando o número de células CD24-CD29- (Figura 1c). Os mesmos resultados foram obtidos quando as células W0069 foram misturadas com um subclone (W0069-202), que possui apenas células CD24-CD29- (Figura Suplementar 1a e b). Em contrapartida, demonstramos que o número de colônias foi aumentado quando o número de células CD24+CD29+ utilizadas foi gradualmente aumentado (Figura Suplementar S1c). Para verificar ainda mais o papel dos CSCs na migração, foram utilizadas células W0069-green fluorescentes, marcadas com proteína, positivas para a presença de CSCs, e misturadas com células CD24-CD29- não marcadas. Ao aumentar o número de células positivas, notamos um aumento no número de colônias formadas pelas células migradas, e todas as colônias formadas eram verdes quando verificadas sob um microscópio de fluorescência, implicando que a migração só pode ser vista quando as células CD24+CD29+ estão presentes na cultura celular (Figura 1d e e). Juntos, esses dados sugerem que os CSCs exibem maior motilidade nas linhas de células cancerosas com mutação Brca1.

CSCs em Brca1-mutant cancer mediate cancer metastasis in vivo

Nextra, avaliamos o papel potencial das CSCs em metástases in vivo. Células CD24+CD29+ e CD24-CD29 recentemente classificadas, bem como subclones positivos ou negativos para os mesmos marcadores da linha celular W0069 foram implantados na glândula mamária de ratos virgens (nus) de 6-8 semanas de idade. Primeiro, notamos que o crescimento tumoral foi mais lento quando as células CD24-CD29 classificadas foram comparadas com as células CD24+CD29+ (Figura 2a e b), o que é consistente com a noção de que esta população enriquece para CSCs.39 Resultados semelhantes foram obtidos quando subclones positivos ou negativos para a presença de CSCs (dados não mostrados). Embora camundongos injetados com células CD24+CD29+ tivessem que ser mortos mais cedo (dia 49-54) do que camundongos injetados com células CD24-CD29- (dia 60-69) devido a maiores cargas tumorais, houve um aumento significativo na presença de metástases no grupo de camundongos injetados com células CD24+CD29+. Em particular, camundongos 3/15 implantados com linhas celulares negativas tinham um pequeno nódulo tumoral no pulmão por camundongo (Figura 2c e d). Em contraste, 13/18 camundongos implantados com linhas celulares positivas foram encontrados com nódulos metastáticos nos pulmões com um total de mais de 100 nódulos (este número pode estar subestimado porque o tamanho da maioria dos nódulos era muito maior e os nódulos não podiam ser contados com precisão quando havia muitos em um pulmão) (Figura 2c e d). Como havia cerca de sete vezes (5000mm3/700mm3) a diferença no tamanho do tumor primário entre os tumores positivos e negativos, tínhamos considerado a possibilidade de que a diferença na metástase pudesse ser atribuída à diferença no crescimento do tumor. No entanto, sabe-se que a metástase tumoral começa em estágios iniciais quando os tumores são pequenos e não em estágios tardios quando são grandes,40 o que argumenta contra esta possibilidade. Além disso, a diferença no número de nódulos é de cerca de 33 vezes (100/3) e a maioria dos nódulos derivados de células duplamente positivas é muito maior do que os derivados de células duplamente negativas, o que destaca a diferente capacidade metastática das duas subpopulações. Em relação à origem dos três nódulos metastáticos, é possível que a população dupla-negativa ainda contenha algumas células com menor capacidade de iniciação e metastática do câncer. Alternativamente, algumas células CD24-CD29- podem ganhar essas habilidades através da desdiferenciação. Estas são questões interessantes que merecem mais investigação.

CD29 e CD49f têm um papel fundamental na mediação da metástase tumoral

Interessantemente, o perfil destes tumores metastáticos através da análise de classificação celular ativada por fluorescência usando marcadores CD24 e CD29 revelou que aqueles das linhas celulares duplamente positivas tinham um perfil semelhante ao dos tumores primários ou da linha celular original do câncer (Figura 3a, à esquerda). Como apenas os CSCs dentro do tumor podem recapitular a heterogeneidade tumoral original, isto indica que os CSCs metástase e impulsiona a formação dos tumores metastáticos. Em contraste, não foram detectadas células CD24 e CD29 duplamente positivas nos tumores derivados das linhas celulares negativas mesmo após a metástase (Figura 3a, à direita), como revelado pela análise de classificação celular ativada por fluorescência. Além disso, conseguimos detectar células CD24+CD29+ por coloração de imunofluorescência em nódulos metastáticos no pulmão a partir de tumores iniciados por implante com células CD24+CD29+ (Figura 3b), mas não a partir de tumores iniciados por implante com células CD24-CD29- (dados não mostrados). Consistente com a observação de que as células CD24+CD29+ têm maior mobilidade do que as células CD24-CD29-, a coloração com anticorpos para CD24 e CD29 também detectou células CD24+CD29+ em células migratórias durante o ensaio de cicatrização de feridas (Figura 3c). Estes resultados apoiam a ideia de que os CSC apresentam maior mobilidade tanto in vitro como in vivo e têm um papel crucial na condução da capacidade metastática dos tumores mamários com mutação Brca1.

Both CD29 (β1 integrin) e CD49f (α6 integrin) são subunidades integrin, que servem como receptores de matriz extracelular.41 Como a matriz extracelular está envolvida na mobilidade celular e metástases cancerígenas,41 estivemos interessados em determinar se o CD29 e o CD49f servem apenas como marcadores para CSCs ou se eles realmente têm um papel crítico na mediação da metástase cancerígena. Primeiro derrubamos células CD29 em células W0069 e CD24+CD29+ usando um pequeno RNA interferente individual (siRNA) visando o quadro de leitura aberto do CD29, e nossos dados revelaram uma migração celular notável, mas não estatisticamente diminuída, de células siCD29 em comparação com células de controle (Figura 4a e b). Como CD29 e CD49f formam heterodímeros, suspeitávamos que o CD49f poderia compensar algumas funções quando a expressão do CD29 fosse prejudicada. Para investigar isso, em seguida derrubamos o CD49f pelo siRNA nessas células (Figura 4a). Nossos dados indicaram que a derrubada do CD49f sozinho também reduziu ligeiramente a capacidade de migração celular para níveis similares observados em células tratadas com siCD29 (Figura 4b). Entretanto, uma redução acentuada na migração celular, mas não na viabilidade celular, foi observada quando ambas foram derrubadas ao mesmo tempo (Figura 4a-d). Os mesmos resultados foram obtidos usando um pool de siRNAs contra quatro regiões diferentes no quadro de leitura aberta destes genes (Figura 2a-c suplementar). Também verificamos a expressão de quatro integrinas relacionadas (integrinas α5 e 7 e integrinas β2 e 3) após derrubar os CD29 e CD49f, e os dados indicam que estes siRNAs não alteraram a expressão de outras integrinas excluindo a atividade inibitória cruzada destes siRNAs para outras integrinas (Figura 2d Suplementar). No conjunto, estes achados implicam que as integrinas α6 e β1 podem ter um papel funcional sobreposto, mas crítico, na migração dos CSCs. Assim, ao classificar as células usando as integrinas α6 e β1 como marcadores, na verdade enriquecemos as células onde estas proteínas podem ter um papel funcional na mediação da migração celular in vitro e metástases cancerígenas in vivo.

CSCs exibiram expressão do gene epitelial a assinatura de transição mesenquimal

Para compreender o mecanismo subjacente à capacidade metastática melhorada dos CSCs, realizamos análises morfológicas e moleculares nas células CD24+CD29+ e CD24-CD29-. Nossa análise indicou que as células CD24-CD29- exibiam mais células E-cadherina ligadas à membrana, um marcador para células epiteliais, do que as células CD24+CD29+ (Figura 4e). A análise qRT-PCR também detectou níveis mais altos de expressão de E-cadherina nas células CD24-CD29- do que nas células CD24+CD29+ (Figura 4f). Consistentes com os níveis de expressão reduzidos de E-cadherina, as células CD24+CD29+ também exibiram níveis de expressão mais elevados de vários genes marcadores para células mesenquimais como revelado pelo qRT-PCR (Figura 4f), e análise de western blot (Figura 2e Suplementar). Como ambos os tipos celulares foram derivados de um carcinoma ductal mamário, a característica mesenquimal melhorada das células CD24+CD29+ sugere que elas sofreram transição epitelial para mesenquimal, o que fornece uma base molecular para o seu aumento de mobilidade in vitro e metástases cancerígenas in vivo.

Em resumo, estudamos o potencial metastático dos CSCs enriquecidos em células CD24+CD29+ isoladas de um modelo de rato Brca1-mutante do cancro da mama, e os nossos dados indicaram que os CSCs mostraram uma capacidade de migração muito maior do que os não CSCs em cultura de tecidos e aumentaram o potencial metastático em ratos aloenxertos-nude. Demonstramos que as células CD24+CD29+ mantiveram uma capacidade de diferenciação e reconstituição da heterogeneidade nos tumores metastáticos, enquanto que as células CD24-CD29- não conseguiram. Entretanto, um achado mais intrigante é que os CD29 e CD49f, que têm sido usados como marcadores para isolar CSCs de tumores mamários de camundongos,39, 42, 43 têm um papel sobreposto, porém crítico, na mediação da migração dos CSCs. Em camundongos, β1-integrina representa a integrina predominantemente expressa nas células epiteliais mamárias e tem um papel crítico na progressão do câncer.44 Enquanto nos cânceres de mama humanos, α6-integrina é expressa em níveis elevados e serve como um fator prognóstico independente, conforme revelado por um estudo com efeito dependente do tempo restrito aos primeiros 2 anos de seguimento.45 Ainda assim, o papel potencial de ambos os genes nos CSCs dos cânceres de mama permanece elusivo. Nossos dados indicaram que a função prejudicada de β1 integrin ou α6 integrin sozinha resulta em um efeito muito mais suave do que derrubar os dois genes simultaneamente. Este achado é consistente com o fato de que ambas as integrinas podem se emparelhar entre si para formar heterodímeros para componentes de matriz extracelular como fibronectina e laminina.41, 46, 47, 48, 49 Tem sido sugerido que uma rede social maligna medeia a adesão celular e a comunicação entre os CSCs e seu microambiente.20, 21 Nosso estudo implica um papel importante das integrinas β1/α6 na mediação desta rede. Especificamente, as integrinas β1/α6 podem intermediar a interação entre CSCs e seu microambiente, transmitindo a sinalização da matriz extracelular para o maquinário celular e levando ao aumento da atividade dos CSCs em termos de viabilidade, diferenciação e metástase.