Tetramisole (Sigma T1512, uma solução de reserva de 10 mg/mL em H2O diluído a aproximadamente 100 μg/mL em sais de ovo) a adição é opcional; esta droga paralisa os vermes e facilita o corte. Corte imediatamente: se muito contraídos, os vermes não libertariam muitos ovos. Use uma lâmina de bisturi fresca todos os dias, pois estes corroem rapidamente. O excesso de tetramisol resultará na formação de um precipitado na solução de NaOCl.
Para um rendimento máximo, podem ser libertados mais ovos, tratando os vermes cortados durante aproximadamente 1 minuto com um volume igual da solução de NaOCl adicionado directamente à gota de corte. Assim que os ovos forem liberados, adicione o mesmo volume de NaOCl utilizado para evitar que os ovos sejam danificados. Este tratamento irá matar os estágios pronucleares e danificar os embriões de uma célula. O tratamento com NaOCl de 3 minutos ainda é necessário antes do tratamento com quitinase para uma digestão uniforme. Para ovos anteriores ao estágio de duas células, no qual a casca ainda é um pouco permeável, adicionar um volume igual de EGM assim que os vermes forem cortados. Depois disso, muitos podem sobreviver ao tratamento com NaOCl e quitinase de 3 minutos, e alguns ainda estarão no estágio de uma célula após o tratamento com quitinase e remoção do envelope vitelino se você trabalhar rápido.
Pipeta de transferência satisfatória são feitas de SMI micropipettor 5- a 30-μL capilares (Fisher 21-380-9C) ou World Precision Instruments capilares de 4-polegadas (1B100F-4), por meio de um duplo puxão sobre uma chama muito pequena. Isto é feito primeiro aquecendo e puxando suavemente para fazer uma seção central fina, depois resfriando brevemente, e depois reaquecendo mais suavemente enquanto mantém o capilar sob tensão para o puxão final. O puxamento ideal produz uma pipeta com uma haste distinta e uma seção estreita gradualmente afunilada de cerca de 3/4-1 polegadas. Um pequeno queimador a gás pode ser feito montando uma agulha de seringa grande numa rolha, com uma pinça de parafuso na tubagem para ajustar o fluxo de gás. Alternativamente, as pipetas de tamanho consistente podem ser feitas puxando um extrator automático. Antes de usar, quebre o capilar até a ponta desejada, cerca de 100-150 μm (três ou quatro vezes o diâmetro do ovo), beliscando entre a unha do polegar e a ponta do dedo ou usando uma lâmina de barbear sob um microscópio de dissecação. Um microscópio Microforge pode ajudar a fazer pipetas consistentes, embora não seja necessário. Mantenha o diâmetro da pipeta pequeno para minimizar a transferência de líquidos. Se os ovos aderirem ao interior da pipeta, muitos podem ser recuperados por lavagem com a solução de NaOCl ou com o EGM à medida que se vai avançando. Espere trocar as pipetas frequentemente, e tenha uma boa alimentação puxada antes de uma sessão de trabalho.
Se a digestão da quitinase não funcionar dentro de 8 min, provavelmente não funcionará de todo. Os problemas mais comuns são o hipoclorito ou o estado fisiológico dos vermes (o primeiro dia de postura parece dar ovos mais duros). O hipoclorito deve ser um lote não expirado, e normalmente torna-se pobre cerca de um mês antes da data de expiração. Mantenha o estoque refrigerado em uma garrafa escura, cheia até perto da parte superior. Misture um tubo de 3 ml pouco antes de começar e mantenha-o em gelo; funcionará por cerca de 3 h e deve ser substituído.
Após o tratamento enzimático e especialmente após a permeabilização, os embriões são bastante pegajosos e vão se aglomerar; isto pode ser minimizado com a pipetagem de um ou apenas alguns de cada vez. Pequenos tufos podem ser quebrados pela expulsão da pipeta com um pouco de força algumas vezes.
As pipetas de permeabilização são puxadas à mão da mesma forma que as pipetas de transferência, usando capilares de injeção Kwik-fil (1B100F-4 da World Precision Instruments). A rosca interna pode ajudar a cortar o envelope vitelino. O puxão ideal dá um longo cónico gradual na secção fina para que possa ser cortado até ao diâmetro desejado. As pipetas são cortadas com uma lâmina de bisturi fresca na Parafilm sob o escopo de dissecação. Um adaptador para a pipeta de boca pode ser feito com tubo Tygon de pequeno diâmetro enfiado numa agulha de seringa presa a um tubo de boca. Encha a ponta da pipeta com EGM de volta ao furo mais largo e teste no primeiro lote de embriões quitinazados; recorte a ponta da pipeta se ela for muito pequena. O tamanho ideal varia de acordo com a idade do embrião que você está tentando obter; os estágios iniciais são mais frágeis e precisam de um furo ligeiramente maior; embriões maiores que oito células se comprimem com menos danos e muitas vezes saem das pipetas maiores com o envelope vitelino intacto. Tais embriões não permeabilizados continuarão a desenvolver-se até ao estádio de eclosão.
Utilizar uma seringa na pipeta de permeabilização da boca para enchimento e limpeza das pipetas; a permeabilização real é feita pela pressão do ar na boca. As pipetas podem ficar no ar durante várias horas sem secar, pois o furo é tão pequeno, mas à medida que secam acabam por se entupir. Guarde as pipetas (uma boa vale a pena guardar, e durará várias semanas) lavando a ponta várias vezes com água destilada e suspendendo a ponta da pipeta num tubo de água destilada estéril ou HCl 0,1 M, usando uma “bandeira” de fita adesiva na pipeta para que esta não se afunde completamente.
Se a pipeta estiver certa, leva apenas alguns minutos para permeabilizar um lote de embriões, aspirando-os individualmente para dentro da pipeta e expelindo-os suavemente. Eles sairão mais ou menos comprimidos, dependendo do diâmetro interno da pipeta, mas arredondar novamente dentro de alguns minutos. Se houver muita lise com permeabilização, ou a digestão estava incompleta ou o diâmetro interno da pipeta era muito pequeno. Como as membranas celulares são bastante lábeis durante 4-5 minutos após o início da citocinese, os embriões desvitelinizados durante e logo após a clivagem podem se fundir ou os blastômeros podem se fundir, mais tarde sofrendo uma clivagem tetrapolar anormal. Se crítico, verifique durante uma experiência e elimine tais embriões.
Uma pestana muito fina (uma ferramenta tradicional de microscopia electrónica) montada num palito com cola é a ferramenta mais satisfatória para uma rápida separação manual dos blastômeros; uma agulha de vidro também funciona, mas parte-se facilmente. Os cílios podem ser limpos com álcool e um lenço de papel. Os blastómeros irão mentir se forem separados logo após uma divisão; 5-10 minutos após a clivagem é o melhor momento para manipulações bem sucedidas, a menos que você precise de separações mais cedo. As separações AB/P1 são as mais fáceis. Os embriões de quatro células também podem ser separados. Alternativamente, para obter blastômeros P2 e EMS, P1 pode ser separado após a primeira divisão e EMS/P2 após a segunda. Os blastômeros de linhagem P podem ser reconhecidos pelo tamanho relativo e sua disposição linear. Com baixo rendimento, MS, E, P3, e C podem ser separados dos quatro descendentes de um blastômero P1 inicial isolado. As identificações celulares feitas com base no tamanho da célula podem ser confirmadas examinando para períodos distintos do ciclo celular.