Introdução
Proteínas fluorescentes (FPs) têm sido usadas como tags de proteínas desde meados dos anos 90, principalmente para biologia celular e microscopia de fluorescência. Estes tags não só revolucionaram a biologia celular ao permitir a imagem de quase qualquer proteína, como também são utilizados em aplicações bioquímicas. Um exemplo importante é a imunoprecipitação e purificação por afinidade das proteínas marcadas com FP, que foi possibilitada pelo desenvolvimento de resinas de afinidade com alto rendimento, pureza e afinidade como as Nano-Traps de ChromoTek (https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/).
Neste blog fornecemos uma revisão de
- proteínas fluorescentes verdes
- proteínas fluorescentes vermelhas
- proteínas auto-rotuladoras, que requerem o acoplamento covalente de uma molécula fluorescente
Tipos de proteínas fluorescentes
A maioria dos investigadores utiliza proteínas intrinsecamente fluorescentes GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP, ou mCherry. Alternativamente, foram introduzidas proteínas extrinsecamente fluorescentes ou auto-rotulantes que requerem o acoplamento covalente de uma molécula fluorescente à proteína não fluorescente, por exemplo, as etiquetas proteicas SNAP, CLIP, e Halo. Estas proteínas fluorescentes auto-rotuláveis têm certas vantagens de desempenho sobre as FPs intrinsecamente devido às suas propriedades fluorescentes.
Figure 1: Estruturas de proteínas fluorescentes.
(A) Proteínas intrinsecamente fluorescentes (PF) como EGFP, GFP, RFP, mNeonGreen, turboGFP etc. partilham apenas um pequeno número de resíduos comuns, mas dobram tudo numa estrutura conservada em barril β. Sua fluorescência surge através da ciclização e oxidação de três resíduos de aminoácidos no centro deste barril (destacado à direita), o que resulta em um cromóforo de dois anéis. Este processo químico é descrito como maturação do cromóforo, é inerente à dobra protéica e depende apenas de variáveis ambientais como temperatura e concentração de oxigênio, mas não de enzimas adicionais. A cor, fotoestabilidade, rendimento quântico e outras propriedades espectrais das proteínas intrinsecamente fluorescentes são resultado de mutações dentro dos aminoácidos que compõem o cromóforo ou que estão localizados nas proximidades do cromóforo.
(B) As proteínas extrinsecamente fluorescentes, como o HaloTag, são não fluorescentes na sua forma basal. Somente se um fluoróforo ativado adequado for adicionado à proteína HaloTag, este fluoróforo será capturado e covalentemente ligado pelo resíduo HaloTag D106, tornando o HaloTag fluorescente. (PDB IDs para estruturas: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)
Proteína Fluorescente Verde (GFP) e seus derivados são ainda as proteínas fluorescentes mais frequentemente utilizadas na pesquisa biomédica. Recentemente, foram introduzidas proteínas fluorescentes verdes adicionais que são derivadas de outros organismos. Estas proteínas possuem a mesma dobra básica que as GFP, mas divergem amplamente em nível de sequência. Portanto, elas requerem ferramentas de pesquisa novas e dedicadas como anticorpos.
O original: GFP
A Proteína Fluorescente Verde foi isolada pela primeira vez da medusa Aequorea victoria em 1962 por Osamu Shimomura. Possui uma longa fluorescência verde Stokes shift (ex 395nm; em 509 nm). 30 anos depois, Douglas Prasher acabou por conseguir clonar a sequência de GFP e Martin Chalfie expressou esta sequência in vivo. Mais tarde, o laboratório Roger Tsien desenvolveu a GFP em um conjunto de verdadeiras ferramentas de pesquisa. Shimomura, Chalfie e Tsien foram premiados com o Prêmio Nobel em 2008. Veja a palestra do Prêmio Nobel de Roger Tsien aqui: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.
Os cientistas desenvolveram uma infinidade de variantes de GFP com propriedades variáveis. Estas FPs têm diferentes propriedades funcionais e espectrais. A primeira melhoria significativa da GFP foi uma mutação (S65T) que aumentou a intensidade e estabilidade do sinal de fluorescência. O pico principal de excitação foi deslocado para 488 nm (Heim et al., 1995). A variante comum EGFP é uma versão projetada da GFP, que facilita o uso prático da GFP em uma variedade de diferentes organismos e células.
Proteína Fluorescente Verde GFP também é conhecida como avGFP, wtGFP, e gfp10; EGFP como GFP e GFPmut1 melhoradas.
https://www.fpbase.org/protein/avgfp/
https://www.fpbase.org/protein/egfp/
TurboGFP
Relatado em 2004, TurboGFP é uma proteína fluorescente verde dimérica de maturação rápida e brilhante derivada de CopGFP do copépode Pontellina plumata. Copepod TurboGFP é evolutivamente distante das proteínas fluorescentes derivadas de medusas como EGFP e compartilha apenas cerca de 20% da identidade da seqüência com as variantes GFP comumente usadas. Portanto, a maioria dos anticorpos anti-GFP incluindo o GFP-Nanobody usado no GFP-Trap não se liga ao TurboGFP.
https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/
mNeonGreen
mNeonGreen é derivado de uma proteína fluorescente amarela multimérica da lanceta Branchiostoma lanceolatum. Assim, o mNeonGreen está evolutivamente distante das alforrecas derivadas de alforrecas. O mNeonGreen e os derivados comuns de GFP partilham apenas cerca de 20% da identidade da sequência. Devido à baixa semelhança de sequência, espera-se que as ferramentas de afinidade (i.e. anticorpos) para as variantes GFP não se liguem ao mNeonGreen. Certamente, isto foi mostrado para os reagentes de afinidade ChromoTek (anticorpos anti-GFP Nanobodies/ VHHs e anticorpos).
Primeiro publicado em 2013, mNeonGreen é até três vezes mais brilhante do que GFP. É uma proteína fluorescente verde/amarelo monomérica versátil e emergente para aplicações de imagem, incluindo microscopia de super-resolução. Além disso, o mNeonGreen atua como aceitador de proteínas fluorescentes ciano em aplicações de transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET). Parece ser a proteína monomérica fluorescente verde mais brilhante conhecida até agora e tem uma taxa de maturação rápida.
https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/
Comparação de GFP, TurboGFP, e mNeonGreen
>
Propriedade |
EGFP (derivado mais comumente usado GFP) |
turboGFP |
mNeonGreen |
|---|---|---|---|
| >
Discovery/ primeira publicação |
|||
| >
Origin > |
>
GFP de alforreca > |
>
CopGFP de copépode Pontellina plumata |
Proteína fluorescente amarela multitimérica de Branchiostoma lanceolatum > |
|
Taxa de maturação (a 37°C) |
25 min |
>
25 min |
10 min |
| >
Sequência de identidade com EGFP |
(100%) |
~20% |
>
~20% |
|
Derivado da GFP? |
Sim |
Não |
Não |
|
Estrutura |
Fraco dimer |
Dimer |
>
Monomer |
|
Variantes comuns |
AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, monomeric eGFP A206K, CFP, eCFP, mCerulean, YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet, BFP |
TurboGFP, CopGFP |
mNeonGreen |
|
Excitação/Emissão máxima |
488 nm/ 509 nm |
482 nm/ 502 nm |
506 nm/ 517 nm |
|
Comprimento/peso molecular (MW) |
239 aminoácidos, |
2x 232 aminoácidos, |
237 aminoácidos, |
| >
Ferramentas de pesquisa oferecidas pela ChromoTek |
Immunoprecipitação: GFP-Trap Western blot: Anticorpo anti-GFP do rato Controle: proteína EGFP purificada |
Immunofluorescência: TurboGFP-Trap |
Imunoprecipitação: mNeonGreen-Trap Borrão ocidental: Anticorpo de rato anti-MNeonGreen |
Proteínas fluorescentes vermelhas (RFPs) são FPs que emitem luz fluorescente vermelho-alaranjada. A primeira RFP que se tornou comercialmente disponível foi a DsRed. Ela foi derivada de anêmonas marinhas Discosoma sp. em 1999.
DRed tem alguns problemas práticos imanentes: (i) Tem um tempo de maturação de cerca de 24 horas, o que o torna inutilizável para experiências de curto(s) tempo(s). (ii) A forma tetramérica do DsRed pode comprometer a função das proteínas às quais ele está ligado. (iii) Sua fotoestabilidade é bastante baixa.
Em consequência, o DsRed foi submetido a mutagênese direcionada ao local para se tornar comumente aplicável como uma etiqueta de fusão codificada geneticamente. Eventualmente, foram criados derivados monoméricos de RFP com melhor desempenho fluorescente (em termos de brilho e fotoestabilidade) e maior eficiência de maturação. Além disso, os derivados foram gerados com fluorescência laranja, vermelha e vermelha distante. Estas versões monoméricas de RFP tornaram-se as valiosas ferramentas de pesquisa mCherry, mOrange, mRaspberry, mPlum (também conhecidas como “mFruits”), mKO, mRFP (também conhecidas como “mFruits”), mKO, mRFP (também conhecidas como “mFruits”). mRFP1), mRFPruby, mRuby, tagRFP, mKate2, e DsRed-Express etc.
RFPs adicionais foram identificados em outros antozoários (ou seja, anémonas e corais), mas estas proteínas também eram, na sua maioria, tetrâmeros. Assim, elas ainda não foram otimizadas para uso em pesquisa.
mRFP (também conhecido como mRFP1)
A primeira variante monomérica do dsRed, projetada geneticamente no laboratório de Roger Tsien, foi simplesmente designada mRFP (ou mRFP1), ou seja, proteína monomérica vermelha fluorescente. Em comparação com a dsRed, a mRFP1 é caracterizada por níveis ligeiramente inferiores de absorção, rendimento quântico e fotoestabilidade. Entretanto, sua taxa de maturação é cerca de 10 vezes mais rápida que a do DsRed, o que resulta em um brilho efetivo similar quando expresso em células vivas.
https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/
mCherry
mCherry é provavelmente a variante mais comumente usada do RFP. É uma proteína monomérica vermelha fluorescente com ampla aplicabilidade como proteína de fusão em vários tipos de células. Como outros mFruit RFPs, mCherry é derivada da variante dsRed mRFP1 via evolução dirigida pelo laboratório de Roger Tsien. Comparado com outros mFruits, o mCherry tem a maior fotoestabilidade, taxa de maturação mais rápida e excelente resistência ao pH. Ele tem, entretanto, um rendimento quântico menor que mRFP1.
https://www.fpbase.org/protein/mcherry/
mPlum
Roger Tsien’s lab também gerou uma derivada monomérica de mRFP1/dsRed, chamada mPlum. Os PFs vermelho distante são benéficos para aplicações de imagem de corpo inteiro porque os principais absorvedores de tecido como água, lipídios e hemoglobina são quase transparentes na faixa de emissão de 650-900 nm. Como a maioria dos RFPs vermelhos, o mPlum possui um turno de Stokes estendido.
https://www.fpbase.org/protein/mplum/
Comparação de mCherry, mRFP (mRFP1), e mPlum
| Propriedade | mCherry | mRFP (mRFP1) | mPlum | |
|---|---|---|---|---|
|
Discovery/ first publicação |
||||
| >
Origin |
DRed from sea anemone |
DRed de anémona do mar > |
DRed de anémona do mar |
|
| >
Maturação (a 37°C) |
15 min |
60 min |
>
100 min |
|
| >
Estrutura > |
>
Monomer |
>
Monomer |
>
Monomer > |
|
|
Aggregação |
não |
não |
>
não |
|
| Excitação/Emissão máxima |
587 nm/ 610 nm |
584 nm/ 607 nm |
590 nm/ 649 nm |
|
|
Comprimento/peso molecular (MW) |
236 aminoácidos, |
228 aminoácidos, |
229 aminoácidos, |
|
|
Ferramentas de pesquisa fornecidas pela ChromoTek |
Immunoprecipitação: RFP-Trap |
Imunoprecipitação: RFP-Trap |
Imunoprecipitação: RFP-Trap |
As etiquetas proteicas extrinsecamente fluorescentes Halo, SNAP, e CLIP requerem a captura covalente de um pequeno ligando fluorescente para se transformarem numa proteína fluorescente. Para este fim, estas etiquetas proteicas auto-etiqueta são derivadas de enzimas que catalisam a formação de ligações químicas: As etiquetas SNAP e CLIP são variantes da O6-alkylguanina-DNA alquiltransferase que reagem com benzilguanina e derivados de benzilcitosina, respectivamente. O HaloTag é derivado de uma haloalcano desalalalenase e reage com alquilvalidos (Figura 1).
Em geral, tanto intrinsecamente como extrinsecamente as proteínas fluorescentes são fundidas a uma proteína de interesse para permitir a sua imagem e detecção celular. Entretanto, as proteínas extrinsecamente fluorescentes requerem a adição de um fluoróforo reativo, o que tem várias vantagens:
- Produtividade quântica e fotoestabilidade superior
- Força fluorescente tanto em células vivas como fixas
- Uma seleção mais ampla de corantes fluorescentes
- Uma única construção genética permite a escolha de fluoróforos distintos para multicor imagem/multiplexidade
- Fluorescência iniciada apenas com a adição do rótulo
A disponibilidade de três proteínas extrinsecamente fluorescentes com diferentes especificidades de substrato/ligarela permite o seu uso ortogonal em experiências multiplexadas, também em combinação com FPs intrínsecos.
Dependente das necessidades experimentais, pode-se usar ligandos permeantes celulares à base de tetrametil-rhodamina (TMR), Verde Oregon, diAcFAM, ou Coumarin, que cruzam prontamente a membrana celular para rotulagem de proteínas intracelulares. Em alternativa, podem ser aplicados ligandos impermeáveis à base de fluoróforos impermeáveis como o Alexa Fluor® 488 e 660 para rotulagem rápida da superfície celular.
Comparação da HaloTag, SNAP-Tag, e CLIP-Tag
| Propriedade | HaloTag | SNAP-Tag | CLIP-Tag |
|---|---|---|---|
|
Discovery/ primeira publicação |
|||
|
Origem |
Haloalkane dehalogenase de Rhodococcus rhodochrous |
humano O6-alquilguanina-DNA-alquiltransferase |
humano O6-alquilguanina-DNA-alquiltransferase |
|
Estrutura |
Monomer |
>
Monomer |
Monomer |
|
Reactividade > |
Derivados do cloroalcano |
O6-derivados de benzilguanina |
Derivados de benzilguanina |
|
Ligandos |
Células corantes permeáveis ou não permeáveis, fluoróforos, biotina e contas |
Células corantes permeáveis ou não permeáveis, fluoróforos, biotina e contas |
Células corantes permeáveis ou não permeáveis, fluoróforos, biotina, e contas |
|
Excitação/Emissão máxima |
Depende do fluoróforo acoplado |
Depende do acoplado fluoróforo |
Depende do fluoróforo acoplado |
|
Comprimento/peso molecular (MW) |
297 aminoácidos, |
182 aminoácidos, |
>
182 aminoácidos, |
|
Ferramentas de pesquisa oferecidas pela ChromoTek |
Immunoprecipitação: Halo-Trap |
Immunoprecipitação: SNAP/CLIP-tag-Trap |
>
Immunoprecipitação: SNAP/CLIP-tag-Trap |
>
HaloTag
>
O HaloTag auto-rotulador foi derivado da enzima haloalkane dehalogenase DhaA de Rhodococcus rhodochrous. Seu site ativo foi geneticamente modificado para ligar irreversivelmente substratos de ligação cloroalcânica. Devido a este tipo de inibição de suicídio, a regeneração do seu sítio catalítico para posterior desalalogenação já não é possível. Dependendo do substrato escolhido, o HaloTag converte-se numa etiqueta proteica fluorescente ou pode ser imobilizado em contas de agarose, por exemplo.
As halalalalalcenoses estão ausentes em células eucarióticas e na maioria dos procariotas, incluindo E. coli, não haverá rotulagem de fundo.
SNAP-tag
A etiqueta proteica auto-etiqueta SNAP-tag é derivada da O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hATG) humana, que, como proteína de tipo selvagem, remove os danos da alquilação do DNA. A variante hAGT resultante usada como SNAP-tag reage covalentemente com derivados de O6-benzilguanina (ou seja, uma etiqueta fluorescente conjugada com guanina ou cloropirimidina deixando grupos através de um ligador benzílico) de uma forma irreversível e altamente específica. Na reacção de etiquetagem, o grupo benzílico substituído do substrato é ligado covalentemente à SNAP-tag.
CLIP-tag
CLIP-tag é uma versão modificada da SNAP-tag, concebida para reagir com benzilcitosina em vez de derivados da benzilguanina. Quando usado em conjunto com SNAP-tag, CLIP-tag permite a rotulagem ortogonal e complementar de duas proteínas simultaneamente na mesma célula.
Um guia para a escolha de proteínas fluorescentes
Shaner N.C., Steinbach P.A. e Tsien R.Y. (2005)
Métodos naturais 2(12), 905-909 doi: 10,1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf
Proteínas fluorescentes verdes:
Proteína fluorescente verde
Tsien R.Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.
Induzida fluorescência verde
Heim, R., Cubitt A.B. e Tsien R.Y. (1995)
Natureza, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0
Base estrutural para a rápida maturação da proteína fluorescente verde Arthropoda
Evdokimov A.G., Pokross M.E., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A e Chudakov D.M. (2006)
Relatos EMBO, 7(10), 1006-1012. doi: 10.1038/sj.embor.7400787.
Uma proteína monomérica verde fluorescente brilhante derivada de Branchiostoma lanceolatum
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J. Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M, Davidson M.W. e Wang J. (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409. doi: 10.1038/nmeth.2413
Proteínas Fluorescentes Vermelhas:
Proteínas fluorescentes monoméricas vermelhas, laranja e amarelas melhoradas derivadas de Discosoma sp. proteína fluorescente vermelha
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E. e Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037
Proteína vermelha fluorescente monomérica
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. e Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699
Evolução de novas proteínas sem anticorpos através de hipermutação somática iterativa
Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. e Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.
Recuperação da Deficiência de Maturação de Proteína Fluorescente Vermelha através de Desenho Racional
Moore M.M., Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. e Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463. doi: 10.1371/journal.pone.0052463.
Halo, SNAP e CLIP:
Sondas de Etiqueta SNAP para o Estudo da Endocitose e Reciclagem
Cole N.B. e Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.1021/cb2004252
Etiquetagem de proteínas específicas do local com SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Protocolos atuais em ciência proteica / conselho editorial, Coligan J.E. et al, 73: 30.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73
Uma etiqueta proteica para rotulagem de multiproteínas em células vivas
Gautier A., Juillerat A., Heinis C., Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. e Johnsson K. (2008)
Chemistry and Biology 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007
HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R, Friedman-Ohana R, Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. e Wood K.V. (2008)
ACS Chem. Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k
Um método geral para a rotulagem covalente de proteínas de fusão com pequenas moléculas in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. e Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.1038/nbt765
Etiquetagem Fluorescente do COS-7 Expressing SNAP-tag Proteínas de Fusão para Imagens Celulares Vivas
Provost C.R. e Sun L. (2010)
Exp. Visualizada 39: 1876, doi: 10.3791/1876
Apenas para uso em pesquisa.
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