Resultados e Discussão
Para entender melhor a formação e reparação de sítios AP resultantes da reparação da excisão de base e da depuração/depurinação espontânea in vivo, medimos o número de sítios endógenos AP em DNA genômico extraído de vários tecidos de ratos adultos e fígado humano transplant-qualidade usando o ensaio ASB (3). O número de locais endógenos de PA variou muito entre os tecidos (Fig. 1)⇓ mas não dentro dos tecidos. O maior número de locais de PA foi detectado no cérebro, com 30 locais de PA por 106 nucleotídeos, seguidos pelo coração e cólon. Em contraste, fígado, rim e pulmão de rato consistentemente mostraram o menor número de locais de PA (8-9 locais de PA por 106 nucleotídeos). O número de locais endógenos de PA no fígado humano foi comparável ao do fígado de ratos. Esses dados indicam que a PA persiste em 50.000-200.000 lesões por célula de mamíferos sob condições fisiológicas normais. O número estável de locais de PA no DNA genômico deve refletir o equilíbrio entre a formação e a reparação dos locais de PA. Possíveis interpretações do maior número de locais endógenos de PA no cérebro são as seguintes: (a) maior taxa de depuração e/ou formação de adutos de DNA endógenos, resultando em mais locais de PA; (b) maior atividade de DNA glicosilase, induzindo mais locais de PA; (c) menor atividade de endonuclease de PA tipo II, causando acúmulo de locais de PA; e (d) menor eficiência de dRp-ase ou β-eliminação, deixando os locais de PA marcados com 5′.
Situações endógenas de PA em ratos e tecidos humanos. O DNA foi extraído a 4°C de tecidos intactos de ratos e fígados humanos normais, e o número de sítios AP foi medido usando o ensaio ASB. A, típico filme de raios X mostrando locais endógenos de PA em tecidos de ratos. O DNA (incluindo amostras de DNA padrão) foi carregado em uma membrana NC (1,5 μg por ranhura). B, escaneando dados densitométricos de locais endógenos de PA em tecidos de ratos e humanos. Colunas, significa de ranhuras duplicadas de cinco a oito amostras individuais; barras, SD.
> O principal processo no reparo de locais de PA é a via endonucleada AP tipo II/β-pol-dependente (7). A endonuclease AP tipo II pode reconhecer os sítios de AP e incisar imediatamente a espinha dorsal do fosfodiéster 5′ para as lesões, deixando um grupo 3′-hydroxyl e um sítio 5′-AP terminus (5). O 5′-dRp é subsequentemente libertado, e a lacuna de nucleotídeo único é preenchida. Foi demonstrado que quantidades significativas de endonuclease AP tipo II estão presentes no núcleo de células de mamíferos (8). Anteriormente, mostramos que a combinação do ensaio de ASB e AP endonuclease tipo II ou NaOH induz 3′ ou 5′ clivagem dos sites de AP, respectivamente (3). Para entender a atividade da endonuclease AP e dRp-ase in vivo, otimizamos ainda mais o ensaio de clivagem do sítio AP. Nesta experiência, utilizamos o Exo III como endonuclease AP tipo II para identificar a clivagem de sites de AP e putrescine para detectar 5′-nicks (Fig. 2)3′. Para caracterizar este ensaio de clivagem de sítios de AP, incubámos ADN que tinha sido pré-tratado com MX para reduzir o número de sítios de AP para 3,8 ± 0,5 sítios de AP por 106 nucleótidos (média ± SD) com calor e tampão ácido. Vários períodos de incubação de calor/ácido induziram 11, 47, 115, e 320 locais de AP por 106 nucleotídeos. Um único tratamento do Exo III reduziu o número de locais de PA em 4-10 locais de PA por 106 nucleotídeos em cada amostra de DNA, independentemente do número inicial presente (Fig. 3)⇓. Esta redução pode ser devida à combinação de incisão enzimática no lado 5′ por Exo III e clivagem não específica 3′ dos sítios de PA durante a incubação com Exo III. Esta clivagem não-específica 3′ impediu a quantificação precisa do número de sítios de AP no DNA com este ensaio. Em contraste, o tratamento com putrescina não mostrou redução no número de sítios de PA. Após incubação com Exo III seguido de putrescina, o número de sítios AP foi reduzido para o número original de sítios AP no DNA do timo do bezerro pré-tratado com MX. A eficiência da clivagem dos sítios de AP pela combinação de Exo III e putrescina foi >99%.
Esquema do ensaio de clivagem do sítio de AP. Para melhor entender as atividades do endonuclease AP tipo II, bem como do dRp-ase in vivo, determinamos a existência de clivagens no lado 5′ ou 3′ dos sites AP em DNA genômico. Putrescine e Exo III (endonuclease AP tipo II) deixam os sites 3′-cleaved e 5′-cleaved AP, respectivamente. Para sítios intactos de PA sem incisão nos lados 3′ e 5′ dos sítios de PA, o ensaio ASB pode teoricamente detectar o número original de sítios de PA após tratamento com Exo III ou putrescina porque os sítios de PA permanecem na espinha dorsal do ADN após incisão em ambos os lados da ligação do fosfodiéster adjacente ao sítio de PA. No entanto, a combinação de Exo III e putrescina cliva-se em ambos os lados 3′ e 5′ do site da PA , resultando na libertação do site da PA da espinha dorsal do ADN. Esses sites de PA liberados não são detectados por este ensaio. Com base no número de sites de AP deixados na espinha dorsal do ADN após esta reacção de clivagem, pode ser estimado o número de sites de AP clivados em 5′ e 3′. Se os sites de AP clivagem de ADN estiverem presentes no ADN, o tratamento único com putrescina pode libertar os sites de AP 5′-nicked por 3′-excisão dos sites de AP . Da mesma forma, os sites AP no ADN 3′-nicked podem ser libertados por 5′-excisão utilizando Exo III .
Ensaio de clivagem de ADN de timo de bezerro tratado com tampão térmico/ácido. Para validar o ensaio de clivagem do sítio AP, examinamos os efeitos do Exo III e da putrescina nos sítios intactos do AP induzidos no DNA do timo de bezerro. O número original de locais de PA no DNA do timo de bezerro foi reduzido por MX (CTD/MX). O DNA foi então incubado em tampão térmico/ácido por diferentes períodos de tempo para introduzir diferentes números de locais de PA intactos (-/-; Ref. 9). O DNA foi incubado com Exo III e/ou putrescina, e o número de sítios AP remanescentes no DNA do timo de bezerro foi medido através do ensaio ASB . Colunas, significa a partir de ranhuras duplicadas de três amostras individuais; barras, SD. A, ensaio de clivagem de AP local de DNA contendo 115 locais de AP por 106 nucleotídeos. B, resumo do ensaio de clivagem de ADN contendo diferentes números de sítios AP.
Aplicamos este ensaio ao ADN genómico extraído de ratos e tecidos humanos para caracterizar sítios AP endógenos. As frações de sítios AP intactos e clivados, e lesões aldeídicas residuais estão resumidas na Fig. 4⇓. O DNA de ratos e tecidos humanos foram incubados com Exo III seguido por putrescina para examinar se as lesões detectadas eram locais reais de AP. Após a clivagem dos sítios de PA em 5′ e 3′, foram detectadas 1,5-2,2 lesões aldeídicas residuais por 106 nucleotídeos. Estes dados indicam que o ensaio ASB mede correctamente os sítios endógenos da PA. As lesões residuais podem ser devidas a limitações de reações enzimáticas no ensaio de clivagem do sítio AP, bem como à presença de lesões endógenas de base aldeídica, como o formilúster (10). Além disso, uma fração combinada dos sítios de clivagem do sítio 3′ e AP intacta foi detectada em ∼2-3 lesões por 106 nucleotídeos em diferentes tecidos, que é 3′/3-1/10 do número total de sítios endógenos de AP. Para examinar o número de sites de AP clivados em 5′, incubamos o DNA com putrescina. A redução dos sítios AP por putrescina (o número original de sítios AP menos o número de sítios AP deixados após a incubação da putrescina) representou o número de sítios AP clivados em 5′. Em contraste com o DNA do timo de bezerro pré-tratado com tampão térmico/ácido, o DNA genômico tratado com putrescina teve um número marcadamente reduzido de locais de PA. Estes dados indicam que aproximadamente dois terços ou mais dos sites endógenos de PA já estão clivados no lado 5′ dos sites de PA in vivo.
Sumário do ensaio de clivagem do sítio AP do DNA do rato e tecido humano. O número original de sites de AP, conforme descrito na legenda da Fig. 1B⇓, consistia em 5′-cleaved, 3′-cleaved, sites de AP intactos, e lesões aldeídicas residuais. O número de sítios de PA clivados em 5′ foi calculado como o número original de sítios de PA menos o número de sítios de PA deixados após o tratamento com putrescina apenas. A fração combinada de locais com AP clivagem 3′ e intactos foi a diferença entre o tratamento com putrescina e o tratamento combinado de Exo III e putrescina. Os sítios residuais de PA mostraram o número de lesões aldeídicas não tratadas.
Após a clivagem dos sítios de PA por endonuclease AP tipo II, os sítios de PA incisada têm que ser subsequentemente liberados da espinha dorsal do DNA através da excisão dos resíduos de 5′-dRp. Esse processo de liberação é possivelmente realizado pela dRp-ase via reação hidrolítica (11) ou β-eliminação (12) ou via uma enzima endonucleolítica que incide a jusante de moieties de 5′-dRp (13). Foi demonstrado que o Xenopus e o humano β-pol liberam 5′-dRp por β-eliminação (14). Usando o tamanho do remendo de reparação em β-pol-null ou – células proficientes, foi demonstrado que uma única via de reparação de fendas foi predominante em β-pol-null mas não em β-pol-null cells (15). Além disso, a interação entre endonuclease AP humana e β-pol acelera a liberação de resíduos de 5′-dRp in vitro (16). No entanto, a eficiência do reparo de moieties 5′-dRp não tem sido bem caracterizada em células ou in vivo. Usando extratos livres de células de levedura, o processamento das moléculas de 5′-dRp foi considerado uma etapa limitadora da taxa durante o reparo da excisão de base de DNA contendo uracil (17). Além disso, foi examinada a eficiência catalítica do β-pol para remover o 5′-dRp (18). Curiosamente, o Kcat de 5′- dRp-ase atividade de β-pol foi ∼100-dois vezes inferior ao Kcat de AP endonuclease. Este estudo demonstra uma clara persistência dos sites de AP incisos do 5′ em ratos e tecidos humanos. Esses dados sugerem que a incisão por endonuclease AP e a subsequente liberação de resíduos de 5′-dRp podem não estar eficientemente ligados a nível basal in vivo e que o processo de reparação de 5′-dRp pode ser uma das etapas limitadoras da taxa de reparação da excisão de base.
No estudo anterior (3), demonstramos que a depuração espontânea ocorreu em 1,5 locais de AP por 106 nucleotídeos por dia em condições fisiológicas. Para testar se os adutos de DNA labial de calor, como N3 e N7-alquil purinas, foram a fonte do maior número de locais endógenos de PA no cérebro, um ensaio de depuração foi realizado no DNA do cérebro e do fígado. Entretanto, nenhuma diferença foi observada no cérebro e no fígado (dados não mostrados). Portanto, o estado estável dos locais endógenos de PA pode não ser devido a lesões na base labial. Uma das mais importantes e abundantes lesões endógenas de DNA é a lesão oxidativa da base de DNA. Foi relatado que o estado estacionário da 5-hidroxicitosina no cérebro de ratos é ∼2 – mais alto do que o do fígado de ratos (19). Essas bases de pirimidina oxidativas são reparadas pelo Fim III, deixando os locais de AP na espinha dorsal do DNA. Para examinar se o estresse oxidativo poderia estar relacionado ao número estável de locais de PA no DNA, os locais sensíveis do Fim III foram quantificados usando a combinação do ensaio ASB e E. coli Fim III. O número de locais sensíveis do Fim III foi três vezes maior no cérebro (14 lesões por 106 nucleotídeos) comparado a outros tecidos (4-5 lesões por 106 nucleotídeos). Recentemente, o homólogo humano do gene End III (hNTH1) foi clonado e caracterizado (20). A expressão do mRNA deste gene varia entre órgãos em um padrão que corresponde ao número de sítios endógenos AP (20). A maioria das glicosilases de DNA envolvidas no reparo de bases oxidadas possui atividade linase AP, que clivam o lado 3′ dos sítios AP. Portanto, os sites endógenos 5′ AP não seriam derivados das clivagens das bases oxidantes por tais DNA glicosilases. Uma experiência preliminar mostrou que o peróxido de hidrogênio com FeSO4 induziu diretamente os sites de PA clivados no DNA do timo de bezerro sem quaisquer enzimas (dados não mostrados). Estes estudos sugerem que o estresse oxidativo pode ser um dos fatores responsáveis pelo estado estável dos sites de PA com clivagem 5′.
Esperávamos originalmente encontrar baixos números de sites endógenos de PA no DNA genômico por causa de sua toxicidade e mutagenicidade. Entretanto, este estudo mostra que o estado estacionário dos sites de PA é ∼1 lesão por 105 nucleotídeos no DNA genômico. Embora os sítios de PA estejam sendo constantemente reparados, a fração dos sítios de PA que escapam à reparação provavelmente contribui para mutações, aberrações cromossômicas e erros de transcrição que podem estar associados a doenças espontâneas relacionadas à idade, como câncer e doenças degenerativas.