7 RAG Binding Genomewide
Dadas as propriedades de ligação direta de DNA do RAG1, combinado com a abundância única de RSSs presentes nos genes receptores de antígenos, era razoável supor que a especificidade local da recombinação V(D)J é simplesmente imposta pelo recrutamento preferencial de RAG1 para seus substratos de DNA preferidos. O RAG2, devido ao seu PHD e à sua falta de atividade catalítica intrínseca, não deveria apresentar restrições funcionais em seus padrões de localização. Assim, o RAG2 se liga amplamente através do genoma linfocitário, ocupando uma fração importante (~ 60%) dos SSTs ativos, que são enriquecidos em H3K4me3 (Ji et al., 2010; Teng et al., 2015). No entanto, as RAG1 também se localizam em milhares de locais (~ 3500 em timócitos de rato e células pré-B) que são co-ocupados por RAG2 e H3K4me3, englobando uma porção substancial de promotores e melhoradores altamente activos e específicos da linhagem (Teng et al., 2015). Esta localização generalizada também é observada para um mutante catalítico de RAG1 (D708A), indicando que a ligação generalizada de RAG1 não reflete o acúmulo pós-folha (Teng et al., 2015). Os sítios de ligação de RAG1 fora dos genes receptores de antígenos não mostraram correlação clara com a presença de motivos semelhantes a RSS (RSSs crípticos, ou cRSSs), indicando ainda que contatos específicos da seqüência e atividade de clivagem mediada por RAG não poderiam explicar os padrões de ligação de RAG1 em todo o genoma. Ao invés disso, os marcadores de acessibilidade da cromatina são os melhores preditores do recrutamento de RAG1: H3K4me3, H3K27Ac, conteúdo GC elevado, e conteúdo CpG elevado (Teng et al., 2015).
Na verdade, apenas alguns exemplos demonstram recrutamento específico de RAG1 para genes receptores de antígenos através de trans-factores que interagem tanto com RAG1 como com motivos de ADN específicos. Em cada caso, a especificidade local do evento de recrutamento não depende do RSS em si, mas de um motivo de ligação do fator de transcrição que se sobrepõe fortuitamente a um RSS. O locus Tcrb do mouse ilustra uma instância em que o recrutamento de RAG1 direcionado contribui para restrições “além de 12/23” que ajudam a manter a ordem correta de recombinação (Dβ-Jβ antes de Vβ-DJβ). Os 3′ 23-RSSs de acompanhamento Dβ1 e Dβ2 contêm sites de ligação conservados para c-fos, uma subunidade do factor de transcrição da AP-1 (Wang et al., 2008). De forma independente de suas propriedades ativadoras transcripcionais, o c-fos recruta preferencialmente RAG1 para o 3′ Dβ RSSs, favorecendo assim a recombinação Dβ-Jβ (Wang et al., 2008). Na linhagem B, o locus receptor de antígeno análogo é o gene Igh, onde a recombinação direta Vh-Dh é desfavorecida em relação à recombinação Vh-DJh. Neste caso, entretanto, a ordem de recombinação parece ser regulada por mudanças locais nas marcas epigenéticas que seguem a recombinação D-Jh, e marcam o produto DJ para ligação e recombinação preferencial RAG1 em relação aos segmentos do gene Dh da linha germinativa (Subrahmanyam et al., 2012). Além disso, a recombinação direta Vh-Dh é suprimida por um elemento de seqüência conhecido como IGCR1 que se encontra entre os grupos de genes D e V (Guo et al., 2011). IGCR1 contém dois sítios CTCF vitais e pensa-se que funcione como um ponto de ancoragem para os loops cromatinosos que sequestram a parte DJ do Igh locus da parte V (Guo et al., 2011; Lin, Guo, Su, Zhang, & Alt, 2015; Medvedovic et al., 2013). O locus Tcrd humano fornece outro exemplo de deposição de RAG1 específica do locus, onde o recrutamento de RAG1 dependente de Runx1 para Dδ2 favorece um evento de rearranjo Dδ2-Dδ3 que precede a clássica recombinação Dδ-Jδ (Cieslak et al., 2014). Isto resulta na inclusão de dois segmentos de genes D em rearranjos Tcrd específicos de humanos. Finalmente, Pax5 foi sugerido para interagir com RAG e facilitar o recrutamento de RAG para segmentos gênicos Vh (Zhang et al., 2006), embora ainda não tenha sido demonstrado que esse mecanismo melhora o conjunto endógeno Igh locus.
Afora essas exceções, a ligação RAG1 não parece iniciar principalmente a partir de eventos de recrutamento específicos da seqüência. Mesmo dentro dos genes Tcr e Ig, a ligação RAG1 estende-se além dos limites do RSS, ocupando regiões intrônicas que são enriquecidas em H3K4me3 mas desprovidas de RSSs (Teng et al., 2015). Isto não quer dizer que as RSSs não desempenhem papéis secundários na estabilização ou melhoria da ligação RAG1 pós-recrutamento. Os genes Tcra e Igk são os principais recrutadores da ligação RAG1 em timócitos duplo-positivos e células pré-B, respectivamente, e picos definidos de acumulação de RAG1 são claramente observados sobre as RSSs em centros de recombinação (Teng et al., 2015). A densidade excepcional de RSSs nos genes receptores de antígenos é provavelmente uma das características mais importantes que os discrimina do restante do genoma.
O genoma em geral, entretanto, exibe recrutamento de RAG1 independente de RSS, que provavelmente ocorre através de interações inespecíficas entre RAG1 e DNA que são mediadas por vários domínios do núcleo RAG1, incluindo o NBD (Teng et al., 2015; Yin et al., 2009). Além disso, o recrutamento indireto de RAG1 para cromatina pode ocorrer através de sua interação com RAG2, embora esta última não possa explicar totalmente os padrões de ligação RAG1, que são parcialmente mantidos na ausência de RAG2, embora com intensidade reduzida (Teng et al., 2015).
A faixa genômica dos sítios de ligação RAG1, embora mais ampla do que o previsto, expande-se ainda mais na ausência de domínios não centrais de RAG1 ou RAG2. Na ausência da região terminal C da RAG2 (que inclui o PHD), a RAG1 se difunde para locais com densidades menores de H3K4me3, em vez de se referir aos SSTs mais ativos (Teng et al., 2015). Uma possibilidade é que isso resulte de uma desmascaração de atividades adicionais de DNA não específicas da RAG1, dada a ausência do domínio auto-inibitório que fica na região terminal C da RAG2 (Lu et al., 2015). Outra possibilidade é que, na ausência do domínio PHD RAG2, o complexo RAG tem menos propensão para abrigar regiões de alta H3K4me3. Também relevante para o padrão vinculante mais amplo das RAG1 pode ser o fato de que a exclusão da região terminal C das RAG2 leva à upregulação dos níveis de proteína das RAG1 (Teng et al., 2015). O núcleo RAG1 também se liga muito mais promiscuamente do que a RAG1 de comprimento total e, intrigantemente, exibe uma intensidade elevada de ligação em muitos locais receptores não antagênicos, mas intensidade reduzida no locus Tcra, em relação à RAG1 de comprimento total (Teng et al., 2015). Isso pode refletir mudanças nas propriedades intrínsecas de ligação do DNA da proteína RAG1 truncada, ou a ausência de atividades codificadas no terminal não central da RAG1 (como a ubiquação do histórico mediado por RING ou a auto-inibição mediada por C-terminus). Também pode ser relevante o fato, observado acima, de que o núcleo da RAG1 é expresso em níveis substancialmente mais altos que a RAG1.
A recombinase da RAG tolera variação de seqüência não apenas em seus substratos, particularmente no espaçador RSS, mas também no heptamer e nonamer (Hesse et al, 1989; Lewis, Agard, Suh, & Czyzyk, 1997; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994; Zhang & Swanson, 2008). Mesmo a interação RAG1-nonamer mediada pelo NBD baseia-se em relativamente poucos contatos específicos de seqüência (Yin et al., 2009). Os RSSs que povoam os genes receptores de antígenos são diversos em seu conteúdo sequencial (às vezes divergindo significativamente dos motivos heptâmeros e não antígenos consensuais), e o reconhecimento do substrato pelo RAG deve ser suficientemente flexível para permitir a máxima diversidade de repertórios. Fora dos genes receptores de antígenos, os locais de ligação RAG1 não mostram preferência cumulativa por qualquer assinatura de seqüência em particular (Teng et al., 2015).
O reconhecimento de substrato flexível por RAG cria um problema para o restante do genoma, entretanto. Os requisitos de sequência bastante mínimos para um RSS funcional (pelo menos, pelas regras que entendemos atualmente) permitem que os cRSSs ocorram com bastante freqüência em genomas de vertebrados (Lewis et al., 1997). O perigo dos EESR fortuitos é evidenciado pela sua participação em rearranjos genéticos dependentes de GAR que contribuem para a linfomagenese (Larmonie et al., 2013). Uma vez que a maioria dos RAG1 ligados através do genoma é governada por recrutamento não específico para DNA ou cromatina acessível, pareceria biologicamente prudente limitar a disponibilidade de RAGS fortes nas proximidades dos locais de ligação dos RAG1 e assim minimizar o potencial para atividade de RAG fora do alvo. De fato, os sítios de ligação RAG1 em camundongos e linfócitos humanos são preferencialmente esgotados de cRSSs (Teng et al., 2015), e propomos que isso tenha acontecido devido a pressões seletivas impostas por rearranjos genéticos que ocorrem fora dos genes receptores de antígenos. Assim, o repertório de EEMTs associados a RAG1 é protegido da atividade de RAG durante a recombinação V(D)J. Especulamos que os raros EEMRs que retêm atividade e continuam a mediar rearranjos ectópicos pouco freqüentes foram mantidos no genoma devido à sua sobreposição com seqüências reguladoras ou funcionais em seus loci hospedeiro, ou simplesmente não exerceram conseqüências negativas suficientemente fortes para serem selecionados contra.