I.U.B.: 3.1.27.5
C.A.S.: 9001-99-4
Reacção enzimática (a imagem será aberta numa nova janela)
Ribonuclease pancreática (RNase) é uma endoribonuclease. Ela catalisa a clivagem da ligação fosfodiéster entre a 5′-ribose de um nucleotídeo e o grupo fosfato ligado à 3′-ribose de um nucleotídeo pirimidina adjacente. Esta clivagem forma um fosfato 2′-3′-cíclico, que é então hidrolisado ao fosfato 3′-nucleósido correspondente.
RNase é encontrado em maior quantidade no pancrease de ruminantes (Barnard 1969). O componente principal da enzima cristalina é a RNase A; um componente menor é a RNase B. A RNase B é a forma glicosilada da RNase A (Beintema et al. 1976).
História:
O trabalho de Jones em 1920 é normalmente citado como o “início” da ribonuclease pancreática (Richards e Wycoff 1971). RNase foi isolado por Dubos e Thompson em 1938 e cristalizado por Kunitz em 1940.
Em 1947 a Worthington foi a primeira empresa a fabricar o RNase cristalino altamente purificado. No início dos anos 50, a empresa Armour preparou uma enzima cristalina bruta, e ofereceu-a a um preço muito acessível. Durante os anos 60 e 70, a RNase A era a favorita para estudar primariamente porque é notavelmente termoestável e está presente em alta concentração em uma fonte acessível, o pâncreas bovino. Estes estudos levaram à elucidação da estrutura cristalina (Anfinsen 1959, Groves 1966 e Scheraga 1967), determinação da sequência de aminoácidos (Smyth et al. 1963), identificação do mecanismo catalítico (Beers 1960) e clarificação das vias de dobragem (Hantgan et al. 1974). RNase A foi a primeira enzima e terceira proteína para a qual foi determinada uma sequência correta de aminoácidos (Raines 1998).
Quatro prémios Nobel foram atribuídos por trabalhos associados com estudos de RNase (Anfinsen, Moore, Stein, e Merrifield). A vasta literatura e numerosos estudos tornaram RNase a enzima mais estudada do século XX (Raines 1998).
Trabalhos recentes continuam a investigar a síntese e maturação de RNase no retículo endoplasmático de células vivas (Geiger et al. 2010). Muito trabalho também continua sendo dedicado ao estudo da dobra e agregação do RNase (Benito et al. 2008, Iwaoka et al. 2008, e Arai et al. 2010). O papel da enzima no desenvolvimento e regulação gênica do câncer está sendo estudado (Shlyakhovenko 2009), e está sendo desenvolvido em agentes quimioterápicos do câncer (Chao et al. 2010).
Especificidade:
RNase A é específica para ligações de nucleósidos de pirimidina (Volkin e Cohn 1953). Acredita-se que a reação ocorra em dois passos. No primeiro passo, a ligação 3′,5′-fosfodiester é clivada, enquanto gera um intermediário fosfodiéster 2′,3′-cíclico. Na segunda etapa, o fosfodiéster cíclico é hidrolisado a um grupo de 3′-monofosfato. O primeiro passo não é específico em relação à base nitrogenada do substrato; entretanto, o segundo passo é absolutamente específico para os nucleotídeos pirimidínicos com fosfatos terminais 2′,3′-cíclicos. O RNase B tem a mesma especificidade que o RNase A, tanto para o citidilato cíclico quanto para o RNA fermentado (Plummer e Hirs 1963). O RNase A mostra uma preferência por substratos maiores (Nogués et al. 1995).
A enzima cliva-se nos resíduos de ciantidina duas vezes mais rápido que nos resíduos de uridil (Richards e Wyckoff 1971). Thr45 foi considerado o mais importante para a mediação da especificidade da pirimidina, tanto pela formação de ligações de hidrogênio com bases de pirimidina como pela exclusão estérica de bases purinas (del Cardayré e Raines 1994). A cadeia lateral do Asp83 é importante para estabilizar o estado de transição durante a clivagem de substratos contendo uridina; este resíduo não tem efeito na cinética da clivagem da cistina (del Cardayré e Raines 1995).
Composição:
A forma da proteína se assemelha a um rim, com os resíduos ativos do local de deposição na clivagem (Richardson 1981, e Raines 1998). A estrutura secundária contém folhas beta longas de quatro cordas anti-paralelas e três folhas alfa curtas (Raines 1998). O RNase A contém quatro ligações de dissulfeto, que são críticas para a estabilidade da enzima nativa. Duas dessas ligações de dissulfeto encontram-se entre uma hélice alfa e uma folha beta e contribuem mais para a estabilidade térmica do que as outras duas (Klink et al. 2000). RNase B é uma glicoproteína contendo em Asn34 um único oligossacarídeo composto de seis resíduos de manose e dois resíduos de N-acetilglucosamina (Tarentino et al. 1970).
Características moleculares:
RNase A é uma proteína pequena, a enzima madura tendo apenas 124 resíduos de aminoácidos, sem carboidratos ligados. A RNase A contém 19 dos 20 aminoácidos, faltando apenas triptofano (Nogués et al. 1995, e Raines 1998). A estrutura tridimensional da RNase A é totalmente codificada pela sua sequência de aminoácidos (White e Anfinsen 1959, e Raines 1998). Todos os oito genes humanos semelhantes à RNase A estão localizados no cromossomo 14. Cada um codifica uma sequência de sinal secreto e contém uma tríade catalítica invariável de duas histidinas e uma lisina com um motivo conservado (CKXXNTF) (Marshall et al. 2008).
As sequências de aminoácidos de muitos homólogos do RNase A foram identificadas, fazendo do RNase A um sistema modelo para evolução molecular de vertebrados (Dyer e Rosenberg 2006). A partir das sequências e sua distribuição por uma gama de espécies foi estabelecido que a RNase A é uma proteína moderna que está evoluindo rapidamente (Doolittle 1992, e Raines 1998).
Número de Adesão da Proteína: P61823
CATH Classification (v. 3.2.0):
- Classe: Alpha-Beta
- Arquitectura: Rolo
- Topologia: P-30 Proteína
Peso molecular:
- RNase A: 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNase B: 14,700 ± 0,3 (Plummer e Hirs 1963)
PH ideal: RNase A: 7,0-7,5 (Marrom e Todd 1955)
Ponto isoelétrico:
- RNase A: 9,3 (Ui 1971)
Coeficiente de Extinção:
- RNase A e B: 8,640 cm-1M-1 (Teórico)
- RNase A: E 1%, 280 = 7,3 (Worthington RNase A)
- RNase B: E 1%, 280 = 5.77 (Teórico, RNase B)
Resíduos de sítio ativo:
- Histidina (H12, H119)
- Lisina (K41)
Ativadores:
- Cloreto de sódio (Weickmann et al. 1981)
- Sulfato (Moosavi-Movahedi et al. 2006)
Inibidores:
- Iões metálicos pesados:
- Inibidor de libertação de ribonuclease (RI), uma proteína de 50 kDa que constitui ≤ 0.01% da proteína no citosol de células de mamíferos (Takahashi 1967)
- Complexo uridine-vanadate (Lindquist et al. 1973)
Aplicações:
- RNA removido durante o isolamento do ADN
- Análise da sequência do ADN
- Ensaio de protecção do RNA
- Quantificação ou mapeamento do RNA
- Purificação do ADN plasmídeo
- Isolamento do ADN genómico
- Marcador de peso molecular