X-ray imaging of the female I. ricinus
Aqui, mostramos que a configuração de raios X CRYTUR (baseada no micro-foco X-RayWorx, a fonte de raios X, e o detector de raios X CRYCAM) é altamente adequada para fornecer uma observação rápida e não destrutiva das estruturas internas impregnadas de ósmio das carraças fêmeas. A Figura 1A mostra os músculos retratores quelicerais que atingem a área dos segundos pares de pernas, a espessura da cutícula, músculos dentro das pernas e palpitações (Fig. 1A, Filme 1). O modelo 3D obtido a partir de imagens de projeção de raios X 2D forneceu mais informações espaciais sobre estruturas superficiais do capitulo feminino (Fig. 1B) comparáveis às imagens de pré-visualização por SEM (Fig. 1D) com a possibilidade resultante de visualizar também algumas estruturas internas (por exemplo, músculos, bases de quelicerae e faringe) em várias fatias virtuais (Fig. 1B). A resolução da tomografia de raios X foi de 8,060 µm e foi calculada com base na análise de Fourier a partir de uma fatia virtual reconstruída na planície lateral presente no meio do objeto reconstruído. Construímos um gráfico do espectro de potência radialmente médio e com base no critério de Rayleigh, avaliamos o sinal de borda de separação do ruído em 8,94% da distância entre o piso do ruído e o valor de pico. Como o modelo de raio X foi reconstruído a partir das imagens de projeção no intervalo de 0° a 180° com o passo 10°, a resolução é tecnicamente quase isotrópica. No entanto, esta resolução não foi suficiente para a observação de peças bucais ninfáceas (Fig. 1C,D, veja a comparação dos tamanhos de peças bucais femininas e ninfáceas com a mesma ampliação).
As partes bucais femininas (A-C) e ninfáceas (D) de Ixodes ricinus imitados por raios X (A,B) e SEM (C,D). (A) A imagem de projeção de raios X mostra quelicerae ancorada dentro da base do capitulo (setas brancas) e músculos retratores de quelicerae (setas pretas). (B) O modelo 3D obtido a partir de imagens de projecção de raios X forneceu uma topografia da boca feminina comparável com a imagem SEM de baixa ampliação (C). Apenas a SEM foi utilizada para observação da parte bucal da ninfa, incluindo sua morfologia interna (D), em contraste com a feminina, onde fatias virtuais transversais da tomografia de raio X nos permitiram imaginar a organização estrutural interna do capitulo, quelicerae, faringe e exosqueleto de quitina. Palp (P), base do capitulo (BC), hipótomo (H), quelicerae (Ch), 1ª e 2ª perna (L1, L2). Barras: 100 μm.
Série SEM
O modelo 3D do aparelho de alimentação de I. ricinus ninfa que foi reconstruído a partir de seções seriadas de resina ultradina revelou relações do salivarium e canal alimentar com os estilos capitulares (chelicerae, hypostome) e outras estruturas associadas, principalmente músculos (Fig. 2, Filmes 2 e 3)14.
O aparelho de alimentação da fase ninfálica não edificada de Ixodes ricinus. Os modelos 3D (A,D,I-N) foram reconstruídos a partir de cortes transversais seriais (B,C,E-H) através de parte capitular imitada por elétrons back-scattered electrons (inset) usando SEM JEOL 7401 F. Barra: 25 µm.
Externamente do capitulo, a saliva e a farinha de sangue são expelidas/sucked into a narrow slit, the preoral canal, formed between the groove of the hypostome on the ventral side and the chelicerae on the dorsal side (Fig. 2A). No Rhipicephalus (antigo Boophilus) microplus, uma fina membrana, também chamada de caleira, sobrepõe-se à ranhura hipostomal12. Curiosamente, esta estrutura estava ausente em Ixodes hexagonus9, Haemaphysalis longicornus15 e I. ricinus. Dentro do capitulo, a saliva/sangue continua na cavidade do salivarium, e este caminho comum termina com a separação de um canal alimentar do salivarium (Fig. 2A,B). Do lado dorsal do carrapato, o canal alimentar está situado abaixo do salivarium. O salivário não é uma estrutura fixa permanente, mas sim criada pela colocação das quelicérulas acima do lado dorsal do hipótamo. O canal alimentar separa-se do caminho comum, abrindo-se para a faringe. Seu teto é formado inicialmente por uma pequena lamela (Fig. 2B, seta verde) que se expande em uma haste curta dentro da profundidade do capitulo (Fig. 2C,I, verde) e continua como uma placa ala maior esclerótica (também conhecida como alae) (Fig. 2E,I, verde). Todas estas estruturas juntas formam um labrum. Na parte inferior do labrum, existe um processo semelhante a um dente adjacente ao orifício da faringe (Fig. 2C,E, setas pretas). Esta estrutura tipo dente foi descrita em I. hexagonus, I. holocyclus e Rhipicephalus microplus9,12,16. O processo em forma de dente parece encaixar em uma ranhura do orifício da faringe, portanto é suposto ser uma parte importante da válvula faríngea. A identificação deste processo do tipo dente como labrum justifica-se pela sua semelhança com o labrum de carrapatos argásidos, que também se estende do telhado faríngeo até o canal alimentar13,16. A estrutura anatômica do canal alimentar, minúsculo labrum e válvula em I. ricinus, é consistente com o lento processo de alimentação destes carrapatos, em que pulsos longos de sucção se alternam com o pulso de secreção salivar durante seu longo período de alimentação sangüínea. Em carrapatos moles, entretanto, o labrum se estende distalmente ao longo de todo o comprimento do canal alimentar. Isto é consistente com o processo de alimentação rápida naqueles carrapatos em que a agitação rápida do labrum é sincronizada com a sucção e salivação rápidas para se alimentar em apenas 1-2 horas13. Com base em nossas observações EM, esta parte anterior do teto faríngeo não estava conectada com os músculos e provavelmente forma uma parte estacionária (suporte) da válvula (Fig. 2B). O telhado faríngeo está ligado a placas sub-hipótonas criando os lados e um piso da faringe (Fig. 2C setas brancas). Estas placas estão ligadas às grandes bandas musculares do dilatador fixadas nos seus lados opostos à cutícula ventral. Os músculos dilatadores anteriores da faringe (ADM, mostrado na Fig. 2C,E,I como estruturas de cor rosa claro) estão situados apenas na parte anterior da faringe e sua contração/relaxe permite abrir/fechar a válvula no orifício faríngeo9,12. As ADM estão fixadas no canto superior e nos lados laterais profundos da parte anterior da faringe. A parte média das paredes da faringe está associada a outro grupo de músculos dilatadores cuja contração expande o lúmen faríngeo para o lado. Estes músculos dilatadores laterais da faringe (LDM) podem ser vistos na Fig. 2G e como estruturas de cor rosa profundo na Fig. 2I,J. O LDM permite o aumento maciço da luz faríngea possivelmente também devido à parede dupla em Y na parte anterior (Fig. 2G) e parede tripla em Y na parte posterior da faringe em uma seção transversal (Fig. 2H) descrita por Arthur et al.9 e Sonenshine e Anderson13. A alternância da contração e relaxamento de ambos os grupos musculares dilatadores dilata a faringe, sincronizada com a abertura da válvula anterior, criando um poderoso pulso de sucção. O relaxamento do LDM, após o fechamento da válvula faríngea, aperta a faringe e conduz o sangue ingerido posteriormente para o esôfago e o intestino grosso. A sincronização de tempo entre a abertura/fecho do orifício faríngeo, coordenada com a abertura e fechamento da válvula faríngea e a compressão/alargamento do lúmen na parte média da faringe permite a sucção, assim como o movimento do alimento para o esôfago e também evita a regurgitação do sangue de volta para o hospedeiro9,12. O revestimento interno da faringe é escleroseado, enquanto a parede do esôfago é revestida por células epiteliais (Fig. 2A). O esôfago passa através do synganglion e funde-se com o midgut (dados não mostrados).
O salivarium é uma grande cavidade situada entre a faringe e a quelicerae (Fig. 2A-E). A parte anterior do salivarium é partilhada tanto para a passagem do sangue como da saliva, depois a faringe é separada do chão do salivarium pela lamela minúscula (ver acima). O teto e os lados laterais do salivário são reforçados pela placa esclerótica (ChP na Fig. 2C,E,F e estrutura vermelha mostrada na Fig. 2M) que se estende mais para dentro da cavidade do corpo do carrapato. Na parte posterior do salivarium, os lados laterais desta placa estão ligados a músculos fixados em extremidades opostas aos lados laterais da cavidade corporal da carraça. Estes músculos laterais do salivarium (LMS), podem ser vistos na Fig. 2E,F,K,L marcados em púrpura clara. A contração dos músculos achata a placa, que está firmemente ligada à parede do salivarium, levando ao estreitamento/fechamento do espaço interno do salivarium, porém somente na sua parte posterior, atrás da separação da faringe.
Outros, o piso da extremidade posterior do salivarium está ligado a um pequeno grupo muscular oblíquo (músculos ligados ao piso do salivarium, MS na Fig. 2E,F,J,N, marcados com azul claro) unidos nas partes opostas à parte superior da parte frontal da faringe. Estes músculos permitem o movimento para cima e para baixo da parte posterior do chão do salivarium. Esses músculos foram descritos em I. holocyclus16 feminino. A possibilidade do assoalho do salivarium poder ser abaixado ou levantado foi proposta anteriormente em conexão com a rápida explosão da saliva, com base no registro de sinais elétricos durante o ingurgitamento de R. microplus e Dermacentor andersoni12,17,18,19,20. Durante a salivação de R. microplus, foram observadas deflexões rápidas (até 30 por segundo) para baixo na condutividade seguidas de picos maiores no final da salivação. Uma explicação para estas medidas são as contrações dos músculos na parte anterior da faringe, acompanhadas de uma pulsação semelhante da membrana sobre o canal alimentar (caleira hipostomal) que abre um canal para a expulsão da saliva20. Supomos que os pequenos músculos oblíquos ligados ao chão do salivário podem gerar vibrações que facilitam o movimento da saliva. Contudo, também os músculos laterais que influenciam o diâmetro do espaço interior da saliva podem participar para expulsar a saliva das partes da boca (não incluídas na animação). Sugerimos que o movimento das chelicerae dentro da pele do hospedeiro também pode ajudar a expelir a saliva do salivarium para a pele do hospedeiro. As bases quelicerárias (ChB na Fig. 2A,B) estão localizadas diretamente acima do salivarium (da vista dorsal) e especulamos que estas estruturas podem localmente comprimir a saliva para ajudar a expulsão da saliva. Extensões das queliceras, que foram ligeiramente assíncronas, foram observadas por microscopia intra-vital de dois fótons diretamente dentro do local de alimentação durante todo o período de ingurgitamento I. scapularis21. Observamos que as queliceras começam a se mover de forma ligeiramente assíncrona após a aplicação de pilocarpina na cutícula dorsal da fêmea I. ricinus não alimentada e parcialmente alimentada (Filmes 5 e 6, respectivamente). As bases quelicerais (ChB na Fig. 2A,B) estão localizadas diretamente acima do salivarium (do ponto de vista dorsal) e podemos especular que estas estruturas podem expandir ou comprimir o salivarium e ajudar a expelir a saliva. A aplicação da pilocarpina, uma droga colinérgica não endógena, é bem conhecida por induzir a salivação indiretamente através do sistema nervoso central do carrapato22, enquanto seu efeito sobre outros tecidos do carrapato permanece obscurecido. Portanto, não podemos excluir o movimento mediado pela pilocarpina de quelicerae em nossos experimentos como um efeito adicional desta droga em carrapatos. Bockenstedt et al. sugeriram que as chelicerae forçam as fibras de colágeno que podem comprimir o local de alimentação, confirmando grandemente nossas hipóteses de expulsão de chelicerae mediada por saliva para o hospedeiro21,
Apenas antes do final da cavidade salivar, dutos salivares pareados entram em seus cantos laterais12. Ambos os ductos salivares estão envoltos numa folha de tecido (TSD na Fig. 2C,E,F,M,N, roxo escuro) que provavelmente prende os ductos salivares de forma flexível aos cantos laterais do salivário.
Simulação da salivação e sucção do sangue com base no modelo 3D
Durante o processo de alimentação em carrapatos ixodídicos, a salivação alterna com a sucção lenta ou rápida do sangue e pode incluir um período de repouso. As percentagens de tempo gasto por cada actividade durante o ingurgitamento feminino são variáveis e baseadas na hora do dia, tamanho das carraças, etc.18. No Filme 4, animamos tanto o canal alimentar como o canal de passagem da saliva com estruturas associadas e mostramos como essas estruturas funcionam. O processo de alimentação da maioria das carraças ixodidas começa com a secreção de substâncias semelhantes a cimento, o que permite que a carraça seja fixada na pele do hospedeiro e sela o espaço entre a lesão alimentar e as partes bucais inseridas23,24,25. O período de salivação pode ser encerrado com uma breve explosão de saliva16,17,18,19. A expulsão da saliva é provavelmente facilitada pela vibração da parte posterior do piso do salivarium; o movimento das bases quelicerais também pode estar em jogo (Filme 6). Antes do início da sucção de sangue, o orifício da parte posterior do salivarium é estreitado pelos músculos laterais estirados entre o teto do salivarium e a parede lateral do corpo do carrapato. Esta acção é seguida pela abertura da válvula faríngea e por uma expansão da faringe anterior causada pela contracção dos músculos dilatadores anteriores. Em seguida, a parte média da faringe é esticada ao longo do seu eixo longitudinal e o sangue é aspirado para dentro da faringe. A válvula faríngea anterior é fechada antes que a parede faríngea seja contraída novamente e o sangue é empurrado posteriormente para o esôfago. Esta onda peristáltica é repetida até que a salivação comece. No início da salivação, os músculos limitadores laterais do salivarium relaxam, ampliando assim a cavidade do salivarium. A descida e subida repetida do teto do salivarium na sua parte posterior provavelmente facilita a entrega da saliva ao canal pré-oral.