Propriedades Bioquímicas e Patogénicas das Algas Shewanella e Shewanella putrefaciens

RESULTADOS

Biotipagem de Shewanella isolados de acordo com dois esquemas separados, com resultados semelhantes (Tabela 1). A maioria dos isolados clínicos (74%) pertenceu a Gilardi biovar 2 (CDC biótipo 2), sendo sacarose e maltose negativa enquanto crescendo em ágar SS e em meios contendo altas concentrações de NaCl. A única grande diferença observada entre o esquema de classificação de Gilardi (6) e o de Weyant et al. (22) foi que os isolados do biovar 3 (sacarose, maltose, SS e NaCl negativo) não foram agrupados pelo sistema de biótipos do CDC. Em contraste com os isolados humanos, o biovar 1 (biótipo CDC 1) predominava (67%) entre as linhagens não-humanas. Essas cepas tipicamente produziram ácido a partir de maltose e/ou sacarose e não conseguiram crescer em ágar com alto teor de sal ou SS. Com base nas recentes propostas taxonômicas de Nozue e outras (15), as cepas biovar 2 (CDC biótipo 2) seriam identificadas como algas S. enquanto todas as cepas biovar 1 (CDC biótipo 1) e 6 das 7 cepas biovar 3 seriam designadas como S. putrefaciens; as demais cepas biovar 3 foram posteriormente identificadas como S. alga. Clinicamente, verificou-se que a alga S. predominava (77%), enquanto a maioria dos isolados não humanos (89%) foi confirmada como sendo S. putrefaciens (Tabela 1).

Todos os 10 isolados de Shewanella, quando testados nos sistemas API 20E, API NFT, RapID NF Plus, e Vitek, foram identificados como S. putrefaciens, com uma exceção. Quatro dos cinco isolados de S. putrefaciens produziram números de perfil inaceitáveis no sistema API 20E (no. 0602026 e 0602006); a quinta estirpe gerou um número de biótipo raro para S. putrefaciens. Todas as estirpes de S. putrefaciens produziram uma excelente identificação como S. putrefaciens no sistema API 20E. O sistema API NFT identificou todas as 10Shewanella isoladas como S. putrefaciens com boas a excelentes identificações, com uma excepção, também uma estirpe de S. putrefaciens (baixo valor discriminatório, 48 h). RapID NF Plus identificou todos os 10Shewanella isolados como S. putrefaciens, com 99,9% de precisão. Da mesma forma, todas as cepas foram identificadas por Vitek (97 a 99% de precisão) como S. putrefaciens, embora três cepas de S. putrefaciensstrains tenham requerido 5 a 9 h de incubação antes da identificação final, em contraste com os resultados de 4 h para as outras 7 cepas. Reações de carboidratos (arabinose e maltose) nos sistemas API 20E, API NFT, e Vitek, no entanto, permitem que a maioria das cepas seja corretamente atribuída aos taxa relevantes (S. putrefaciens e S. alga) se lidas manualmente após identificações finais como S. putrefaciens.

Comparação das propriedades bioquímicas e enzimáticas da espécie Shewanella revelou uma série de diferenças (Tabela 2). Hemólise em ágar sangue de ovelha, como relatado por Nozue et al. (15), foi detectada em todas as linhagens de S. putrefaciens, mas apenas em alguns isolados de S. putrefaciens. A maioria das cepas de S. alga exibiu este fenótipo apenas após incubação prolongada (48 a 72 h), e a área de hemólise foi frequentemente irregular e difícil de detectar. Outras atividades anteriormente encontradas para auxiliar na separação de S. alga e S. putrefaciens, tais como crescimento a 42°C, crescimento em meios contendo altas concentrações de sal (6,5%), e produção ácida de l-arabinose, sacarose e maltose, foram confirmadas. Encontramos um número substancialmente maior de cepas de S. putrefaciens que cresceram em ágar SS do que anteriormente relatado; a maioria delas originou-se de fontes não-humanas. Com exceção da ribose, a produção de ácido a partir da oxidação dos carboidratos foi unicamente associada com o S. putrefaciens. Os padrões de açúcar, entretanto, variaram consideravelmente entre estes isolados, com alguns sendo arabinose, maltose e sacarose positivos, enquanto outros foram positivos apenas para maltose ou foram asacarolíticos (cepas biovar 3). Várias novas atividades enzimáticas foram detectadas entre seletos isolados de Shewanella que, ao nosso conhecimento, não foram relatadas anteriormente. Estas incluíam tirosinase, alquilsulfatase, quitinase e atividades de elastase (Tabela 2); a maioria destas enzimas foram encontradas em isolados não humanos deS. putrefaciens. A maioria das cepas de S. alga e S. putrefaciens produziram um sideróforo, conforme determinado pelos ensaios do Cromo Azurol S. Esta atividade foi fraca, e cinco isolados (três de S. alga e dois de S. putrefaciens isolados) não conseguiram crescer neste meio.

Select Shewanella isolados que cresceram bem a 35°C foram ainda mais caracterizados para a actividade enzimática usando API-ZYM (Tabela 3) e para perfis celulares de ácidos gordos com o sistema MIDI. Dos nove substratos atacados por uma ou ambas as espécies de Shewanella com API-ZYM, atividades globais mais altas para sete dessas enzimas foram associadas com a alga S. A única actividade encontrada mais forte em S. putrefaciens foi a arilamidase valina, embora esta actividade tenha sido extremamente fraca mesmo nestas estirpes. Ambas as espécies produziram uma atividade de fosfatase alcalina uniformemente forte. Uma observação adicional foi que todas as linhagens de S. alga produziram consistentemente oito dessas nove enzimas, a única exceção foi a arylamidase valina. Em contraste, S. putrefaciens era mais heterogênea, com quatro das nove enzimas detectadas não estando universalmente presentes em todos os isolados. A análise de 14 cepas de Shewanella indicou que os ácidos graxos predominantes eram i-15:0, 17:1ω8c, e 16:0; algumas cepas produziram grandes quantidades de 16:1ω7c (9 a 18%), enquanto outras produziram quantidades insignificantes. Embora a maioria dos picos de ácidos graxos fossem bastante consistentes entre as cepas de S. alga e S. putrefaciens testadas, foram observadas várias diferenças (Tabela 4). Valores médios mais altos de ácido pentadecanóico e ácido cis-9-heptadecenóico (17:1ω8c) foram notados para a alga S., enquanto o inverso se manteve verdadeiro para S. putrefaciens em relação aos ácidos hexadecanóico e dodecanóico. Para o ácido hexadecanóico, nenhuma sobreposição na faixa total de ácidos graxos entre S. alga e S. putrefaciens foi observada; para o ácido pentadecanóico e 17:1ω8c, apenas um S. putrefaciens ou S. alga isolada produziu um valor que caiu dentro da faixa do outro. Embora nenhum único pico tenha sido diagnosticado, o uso dos quatro picos juntos separou claramente as cepas de 14Shewanella em dois grupos ao longo das linhas de espécies.

Quatro de cinco estirpes de S. putrefaciens ligadas fracamente (+) a fortes (+++) (Tabela 6) a células HEp-2 em ensaios de aderência; em contraste, nenhuma estirpe de algas S. apresentou características adesivas semelhantes, embora quatro estirpes ligadas fortemente ao fundo da lâmina de vidro. Atividades invasivas não foram detectadas em nenhuma cepaShewanella. Embora uma reação hemolítica tardia tenha sido observada em ágar sangue de ovelha para todas as cinco cepas de algas S. (Tabela 2), a beta-hemólise não foi detectada com a técnica de sobreposição de ágar ou ensaios de caldo (Tabela 6); as cepas controle E. tarda foram positivas em 1 h em ambos os testes. Para todas as cinco cepas de S. alga (e um S. putrefaciens isolado), uma reação citotóxica fraca foi às vezes observada durante os estudos de adesão e invasão. Esta reação citotóxica foi manifestada pelo aparecimento de células HEp-2 com morfologia celular anormal, incluindo detritos celulares (fantasmas). Diferenças na patogenicidade do rato entre estas duas espécies foram encontradas, no entanto, como o LD50 médio em ratos Webster suíços para S. algas foi de 1,9 × 108 UFC, enquanto que para S. putrefaciens foi de 8,4 × 108 UFC (P < 0,02).