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Correcção e sinais de reconhecimento

Um sistema modelo para terapia de reposição enzimática surgiu de estudos de fibroblastos cutâneos de cultura derivados de pacientes com doenças de armazenamento de mucopolissacarídeos (MPS). Tais fibroblastos mostraram acúmulo excessivo de glicosaminoglicanos, o que foi interpretado como sendo devido à degradação inadequada dessas macromoléculas. Descobriu-se serendipitalmente que uma mistura de fibroblastos derivados de pacientes com MPS I (síndrome de Hurler) e MPS II (síndrome de Hunter) tinham um padrão normal de metabolismo dos glicosaminoglicanos (Figura 1) . Sabia-se que as duas doenças eram geneticamente distintas, sendo a MPS I herdada de forma autossômica recessiva e a MPS II um distúrbio ligado ao X, levando Fratantoni et al. a supor que os fibroblastos de diferentes genótipos estavam fornecendo um ao outro o produto genético em falta. Outros estudos mostraram que não era necessário ter as células geneticamente distintas em contato umas com as outras para tal correção cruzada, já que o meio condicionado por um poderia ser corretivo para o outro. A estratégia de correção cruzada poderia ser estendida a doenças relacionadas – células que corrigissem uma à outra teriam um genótipo diferente, enquanto células que não corrigissem cruzadas teriam o mesmo genótipo (mas veja a importante exceção abaixo).

Como a síndrome de Hurler tinha sido postulada como sendo uma doença de armazenamento lisossômico baseada na observação dos lisossomos hepáticos dramaticamente inchados em pacientes afetados, Fratantoni et al. colocaram a hipótese de que os ‘fatores corretivos’ em meio condicionado poderiam ser enzimas lisossômicas que foram secretadas por uma linha celular e endocitosadas pela outra. Entretanto, os fatores corretivos não correspondiam a nenhuma enzima lisossômica conhecida na época (esta situação mudou alguns anos depois, quando foi descoberta uma deficiência de MPS de glucuronidase em β). A purificação dos fatores corretivos de Hurler e Hunter foi realizada, não a partir do meio condicionado, mas da urina, um fluido corporal relativamente rico em enzimas lisossômicas. A função foi atribuída aos fatores purificados usando uma variedade de métodos bioquímicos, resultando no nome dos fatores corretivos de Hurler e Hunter α-l-iduronidase e iduronidase sulfatase respectivamente .

Células que exigiam fator corretivo de Hurler para normalizar seu metabolismo glicosaminoglicano (de pacientes com síndrome de Hurler e com síndrome de Scheie ) também eram deficientes na atividade da α-l-iduronidase ). A correção dos fibroblastos de Hurler foi acompanhada pela absorção da α-l-iduronidase. Como bons portentos para terapia de reposição enzimática, a absorção foi notavelmente eficiente e apenas uma quantidade muito pequena de α-l-iduronidase teve que ser internalizada a fim de fornecer correção completa.

Este poderia ter sido o fim da história, exceto por uma pequena discrepância no padrão de eluição da atividade enzimática e a atividade corretiva de uma coluna de hidroxiapatita, sugerindo que as duas atividades do fator corretivo de Hurler não eram precisamente idênticas. Na sequência desta discrepância, Shapiro et al. separaram α-l-iduronidase em frações corretivas e não corretivas em uma coluna de heparina-separina, indicando que o fator corretivo tinha alguma característica que não era necessária para a atividade catalítica, mas que era necessária para a absorção. Similarmente, múltiplas formas de β-glucuronidase foram encontradas, diferindo em captação e atividade corretiva .

A existência de um sinal específico para captação de uma enzima lisossômica foi sugerida pelos resultados de um estudo sobre um distúrbio recém-descoberto, semelhante à MPS – chamada doença de célula de inclusão (doença de célula I), devido às inclusões de fase proeminentes nos fibroblastos cultivados. Enquanto esses fibroblastos apresentavam múltiplas deficiências de enzimas lisossômicas, o meio que os envolvia continha um grande excesso de enzimas lisossômicas. Entretanto, as enzimas secretadas pelos fibroblastos da doença de I-células não foram endocitosadas por outras células e não foram corretivas; presumivelmente, faltava-lhes o sinal para a absorção pelos lisossomas . Como várias enzimas lisossômicas foram afetadas por este único defeito genético (a doença de células I é herdada de forma autossômica recessiva), o sinal foi postulado para ser uma modificação pós-tradução das proteínas enzimáticas. Postulou-se ainda a presença de carboidratos na natureza, pois estes poderiam ser destruídos por um tratamento de periodato leve. O conceito de um sistema de reconhecimento baseado em carboidratos foi fortemente influenciado pelas descobertas de Ashwell e colegas sobre o papel dos carboidratos na absorção de glicoproteínas circulantes pelo fígado .

A presença de um sinal específico reconhecível implicava um processo saturável, mediado por receptores, e sugeria que a absorção de enzimas lisossômicas seguiria a cinética de Michaelis-Menten. Era esperado que os análogos dos sinais de reconhecimento se comportassem como inibidores competitivos da absorção. Esta expectativa foi investigada através da absorção de α-l-iduronidase e de β-glucuronidase pelos fibroblastos deficientes correspondentes. A descoberta por Kaplan et al. de que o melhor inibidor da captação da β-glucuronidase era a manose-6-fosfato (M6P), e sua sugestão de que a M6P era (ou fazia parte) o sinal de reconhecimento há muito procurado, foi assustadora, já que nenhum carboidrato fosforilado havia sido relatado anteriormente sobre as glicoproteínas de mamíferos. Foi imediatamente confirmada a absorção da α-l-iduronidase e outras enzimas lisossômicas, usando uma variedade de métodos bioquímicos; a prova final veio da análise estrutural dos grupos de carboidratos fosforilados. O sinal descoberto através da endocitose provou ser também o sinal para o direcionamento das hidrolases nascentes para lisossomos .

O defeito na doença das células I, que impede que as células sintetizem o sinal de reconhecimento da M6P, demonstrou ser uma deficiência da primeira de duas enzimas envolvidas na síntese do sinal da M6P . Dois receptores para M6P foram descobertos; a química e biologia dos receptores de M6P e seu papel no tráfico celular se tornaram um campo amplo e muito ativo da biologia celular . Estes tópicos são os temas de muitas revisões, incluindo os Capítulos 3 e 5 deste volume. O significado do sistema M6P para a terapia de reposição enzimática será discutido abaixo.

Concorrendo com estes estudos em fibroblastos cultivados, um sistema in-vivo levou à descoberta de outro sinal para a absorção de enzimas lisossômicas. Várias enzimas lisossômicas, injetadas intravenosamente em ratos, foram retiradas rapidamente da circulação; entretanto, elas persistiram por muito mais tempo se pré-tratadas com periodato ou se co-injetadas com uma agalactoglicoproteína. Novamente, os carboidratos foram postulados para fornecer sinais de reconhecimento específico. Neste caso, o açúcar chave para o reconhecimento foi a manose, e a absorção foi em células reticuloendoteliais do fígado. O receptor de manose, que reconhece a N-acetilglucosamina e l-fucose, bem como a manose, mostrou que ocorre na superfície dos macrófagos. É de algum interesse histórico que os experimentos de captação da invertase, que figuraram de forma proeminente na proposta original da terapia de reposição enzimática (ver acima), foram bem sucedidos porque a invertase é uma glicoproteína com cadeias de manan que são reconhecidas pelo receptor de manose .