Relógios biológicos Kircadian são osciladores bioquímicos que ciclam aproximadamente a cada 24 horas e que podem ser reiniciados (arrastados) pela exposição à luz e outros sinais ambientais. Nos animais existe um oscilador central no cérebro que controla o comportamento circadiano de todo o organismo, bem como osciladores periféricos em alguns tecidos. A oscilação surge de um loop de retroalimentação transcripcional envolvendo um conjunto de fatores de transcrição do relógio, incluindo intemporal (Tim), período (Per), relógio (Clk) e Bmal1, bem como criptocromos. Os criptocromos são ubíquamente expressos nos órgãos e tecidos de todos os organismos, e são geralmente proteínas nucleares que regulam a expressão gênica. Os criptocromos animais mais estudados são o Drosophila cryptochrome Cry e os criptocromos de rato Cry1 e Cry2 , e os dois criptocromos arábidopsis CRY1 e CRY2 também foram extensivamente estudados.
Drosophilacryptochromes
Drosophila Cry é uma proteína predominantemente nuclear que mede a regulação do relógio circadiano pela luz , embora também possa ser encontrada no citosol . Ele regula o relógio circadiano interagindo diretamente com a proteína Tim para suprimir o ciclo de feedback negativo do relógio (Figura 3a). A luz estimula a interação Cry-Tim, que promove a ubiquitinação e degradação dependente do proteoma do Tim e reprime a formação do heterodímero Per-Tim. A inibição de um heterodímero das proteínas do Relógio e do Ciclo pelo heterodímero Per-Tim é assim liberada e a fase de oscilação circadiana é reiniciada (Figura 3a). O criptocromo não é aparentemente o único fotorreceptor que entra no relógio circadiano em Drosophila, no entanto. O ritmo comportamental da mosca cribmutante, que carece da função Cry, pode, no entanto, ser arrastado em resposta à luz, a menos que a transdução do sinal pelo pigmento visual também seja eliminada. Além de seu papel como fotorreceptor para o arrastamento do oscilador central de Drosophila, o Cry também tem um papel independente da luz na função do oscilador periférico circadiano .
Regulação do relógio circadiano por criptocromos de animais. (a) Em Drosophila, o Cry suprime o ciclo de feedback negativo do relógio circadiano ligando-se ao Tim de forma dependente da luz; isto resulta na degradação do Tim (Ubq, ubiquitinação) mediada pela ubiquitina dependente do proteoma e, portanto, na inibição da ação do heterodímero Per-Tim. Sem o Cry, o heterodímero Per-Tim entraria no núcleo e inibiria a ligação das proteínas do ciclo do relógio (Per, Clk e Bmal1) à caixa E nos promotores dos genes do relógio, impedindo a sua expressão. (b) Nos mamíferos, os criptocromos são partes integrantes do ciclo de feedback negativo. A proteína Cry interage com Per para reprimir a atividade dos fatores de transcrição Clk e Bmal1 e assim reprimir a transcrição. Os criptocromos também podem estar envolvidos na foto-entrada do relógio circadiano dos mamíferos; sabe-se que os genes do relógio são regulados em resposta aos sinais neurais da retina em resposta à luz, mas ainda não está claro se isto envolve criptocromos.
Criptocromos de mamíferos
As duas funções do Drosophila Cry – como um fotorreceptor para a entrada do relógio circadiano junto com pigmentos visuais e como um componente integral do complexo proteico do oscilador circadiano – são também características dos criptocromos de mamíferos. Os criptocromos de mamíferos são predominantemente proteínas nucleares , mas também podem ser encontrados no citosol . Tal como o Drosophila Cry, os criptocromos de mamíferos desempenham funções dependentes da luz e independentes da luz na regulação do relógio circadiano. Várias observações demonstram o papel dependente da luz das proteínas Cry dos mamíferos. Ratos knockout sem um ou ambos os genes Cry têm uma capacidade reduzida ou abolida de induzir a expressão de genes como per e o protooncogene c-fos em resposta à luz . Além disso, as pupilas de ratos mutantes sem Cry1 e Cry2 têm respostas reflexas reduzidas à luz .
Por outro lado, o rato cry1 cry2 duplo mutante mostra uma ritmicidade aparentemente normal em condições de ciclo claro-escuro, mas perde a ritmicidade instantânea e completamente em condições de funcionamento livre (sempre escuro) . Estas observações indicam que as proteínas Cry desempenham uma função essencial e independente da luz no oscilador central circadiano dos mamíferos, e que os criptocromos não são os únicos fotorreceptores a mediar o controlo da luz do relógio. O facto de os criptocromos serem partes integrantes do oscilador central do rato torna quase impossível testar directamente o seu papel na entrada de luz do relógio. No entanto, descobriu-se que, algo análogo à situação do Drosophila, o choro do rato mantém a sua capacidade de mediar a entrada de luz, a menos que a função dos pigmentos visuais também seja perturbada ao mesmo tempo. Ratos triplamente mutantes portadores de mutações de ambos os criptocromos juntamente com uma mutação retinal-degenerativa são quase arrítmicos sob condições de ciclo luz-escuro. Estes resultados demonstram que as proteínas Cry dos mamíferos estão realmente envolvidas na regulação do relógio circadiano pela luz, mas o seu papel no arrastamento da luz do relógio circadiano é desempenhado de forma redundante por outros fotorreceptores. Parece claro agora que os fotorreceptores adicionais agindo em conjunto com os criptocromos para a entrada do oscilador circadiano de mamíferos são as opsinas de ossos de varetas visuais e a melanopsina protéica relacionada .
Crito de Drosophila, os criptocromos de mamíferos interagem fisicamente com as proteínas do relógio, incluindo os reguladores de transcrição de ligação do promotor Per, Clk e Bmal1 (Figura 3b). Em contraste com o Drosophila Cry, as proteínas Cry de mamíferos são componentes do ciclo de alimentação negativa do relógio circadiano (Figura 3b). A interação física do criptocromo com outros componentes do relógio afeta sua atividade, interação, degradação ou tráfico nuclear, e consequentemente altera a regulação transcripcional dos genes do relógio. Mas a interação entre os criptocromos e outras proteínas do relógio como Per, Clk e Bmal1 parece não ser afetada pela luz, sugerindo que tais interações podem não ser o mecanismo de foto-entrelação do relógio circadiano, como são em Drosophila. Além da regulação direta da transcrição via interação física com os reguladores de transcrição promotores, os criptocromos também podem afetar o relógio circadiano participando da regulação das modificações do histone, mas como isso funciona ainda não foi esclarecido.
Arabidopsiscryptochromes
Arabidopsis CRY1 e CRY2 são proteínas predominantemente nucleares que medeiam a regulação da expressão gênica e o arrastamento do relógio circadiano em resposta à luz . CRY1 e CRY2 desempenham papéis importantes na fotomorfogênese das plantas, como inibição do alongamento do caule pela luz azul, estimulação da expansão da folha pela luz azul e regulação da iniciação floral pelo comprimento do dia. Parece que os criptocromos controlam as alterações do desenvolvimento das plantas através de alterações da expressão gênica em resposta à luz. CRY1 e CRY2 juntos são responsáveis por mudanças dependentes da luz azul na expressão gênica de até 10-20% do genoma Arabidopsis .
Existem pelo menos dois mecanismos pelos quais os criptocromos podem afetar as mudanças na expressão gênica nuclear em resposta à luz. Primeiro, uma molécula criptocromada pode interagir com proteínas associadas a maquinaria transcripcional para afectar directamente a transcrição. A Arabidopsis CRY2 liga-se à cromatina de uma forma independente da seqüência de DNA (e M. Maymon e C.L., observações inéditas), mas não está claro como uma proteína que interage com a cromatina de forma independente da seqüência pode regular a expressão gênica. Ao contrário dos criptocromos animais que mostraram regular a transcrição através de interações físicas com os reguladores de transcrição promotores, nenhuma interação desse tipo foi relatada para os criptocromos vegetais. Um modelo alternativo é que os criptocromos de plantas podem interagir com proteínas que exercem outras funções celulares para regular a estabilidade, modificação, tráfico celular dos reguladores transcripcionais. Por exemplo, foi descoberto que os criptocromos de plantas interagem com uma ligase ubiquitina E3, COP1, sugerindo que os criptocromos de plantas podem agir da forma ainda não descoberta para os criptocromos de animais. Consistente com esta visão, também foi descoberto recentemente que os criptocromos de Arabidopsis mediam a supressão pela luz azul da degradação dependente do proteoma de um importante regulador floral, CONSTANS . Exatamente como os criptocromos fazem isso precisa ser investigado mais a fundo.
Mecanismo
O mecanismo catalítico dos criptocromos não foi completamente elucidado, mas algumas pistas podem ser encontradas no mecanismo das fotolises de CPD, onde o DAD desempenha o principal papel catalítico. Em uma reação de reparo de DNA, a fotolise de CPD se liga ao dímero de pirimidina do DNA e a ‘vira’ de dentro do DNA duplex para a cavidade de acesso ao DAD da enzima, para formar um complexo estável. O outro cromóforo (pterina ou deazaflavina), que também é chamado de cromóforo ‘antena’, absorve fótons de luz azul ou UV-A, e transfere a energia de excitação para o sabor do DAD. Flavin no estado excitado doa um elétron ao regulador de pirimidina para dividir o anel do ciclobutano. O elétron é transferido de volta à flavina neste processo, resultando na regeneração da flavina em estado fundido. O dinucleotídeo reparado não cabe mais na cavidade de acesso ao DAD, por isso se desassocia da fotolise. O papel exato do DAD e da cavidade de acesso ao DAD na função dos criptocromos permanece pouco claro, mas é concebível que ele também possa estar envolvido em reações de transferência de elétrons.
Embora a região do DAD que contém o(s) cromóforo(s) seja a parte mais conservada das proteínas, o domínio carboxi-terminal tem demonstrado ter um papel na função ou regulação dos criptocromos animais e vegetais. A expressão dos domínios carboxi-terminais dos criptocromos de Arabidopsis fundidos à enzima marcadora b-glucuronidase confere uma resposta de crescimento constitutiva à luz mesmo na escuridão, na ausência da região PHR. Em contraste, as regiões de PHR dos criptocromos de Drosophila e Xenopus são fisiologicamente activas na ausência do domínio carboxi-terminal . O domínio carboxi-terminal do Drosophila Cry é importante para a estabilidade proteica, interação com Tim, e sensibilidade do fotorreceptor aos sinais circadianos de luz , enquanto o domínio carboxi-terminal do Xenopus Cry é necessário para sua localização nuclear .
Cryptochromes são regulados por fosforilação. Foi demonstrado que os criptocromos de Arabidopsis são fosforilados em resposta à luz azul e que isto está associado com a função e regulação dos fotorreceptores . Além disso, quando o CRY1 da Arabidopsis foi expresso em células de insetos, verificou-se que ele foi submetido à auto-fosforilação dependente de ATP e de luz azul. Não se sabe se os criptocromos de animais também se ligam ao ATP, embora tenha sido demonstrado que os criptocromos de ratos são fosforilados .
A interacção entre a região de CRY1 PHR da Arabidopsis e o ATP tem algumas características interessantes que lembram a interacção entre o dimer da pirimidina e a fotolise: os grupos fosfatos do ATP são expostos ao solvente; as moléculas adenina e ribose são enterradas nas profundezas da cavidade de acesso ao FAD; e o ATP pode ter um contacto mediado pela água com o FAD . A interação da região CRY1 pHR da Arabidopsis com ATP também carece de várias características comumente encontradas nas interações proteína-ATP, tais como interação proteína-fosfato, contato proteína-para-Mg2+ e um resíduo sereno próximo para transferência de fosfo-transferência . Um exame da topologia da estrutura da região CRY1 PHR mostra, entretanto, que todas essas características poderiam ser potencialmente fornecidas pelo domínio carboxi-terminal do criptocromo (Figura 4). A observação de que os domínios carboxi-terminais ricos em carboxi de criptocromos arábicos fundidos com β-glucuronidase são constitutivamente fosforilados in vivo (, sugere que pode ocorrer uma transferência de fosfotransferência de ATP ligado à cavidade de acesso FAD para o domínio carboxi-terminal próximo (Figura 4a). Também é concebível que o DAD excitado por fótons possa desencadear transferência de elétrons para o nucleotídeo e transferência de fosfotransferência de ATP para resíduos serenos no domínio carboxi-terminal. Como a superfície da região PHR é predominantemente carregada negativamente, especialmente no local onde o domínio carboxi-terminal é susceptível de interagir com ele, o domínio carboxi-terminal fosforilado seria então repelido da superfície da região PHR, resultando numa mudança de conformação criptocromática. Essa alteração conformacional permitiria que ele interagisse com outras proteínas de sinalização e propagasse o sinal luminoso (Figura 4a). Alternativamente, outra molécula de ligação do criptocromo à cavidade de acesso ao DAD também pode fornecer as características em falta necessárias para uma interação produtiva ATP-criptocromo. De fato, tanto a interação CRY2-CRY2 quanto as interações CRY1-CRY2 podem ser detectadas em Arabidopsis (D. Shalitin, X. Yu, e C.L., observações não publicadas). A formação de um homo-oligômero ou de um hetero-oligômero de criptocromos proporcionaria um mecanismo de transferência intermolecular de fosfotransferência, que pode mudar a estrutura dos criptocromos (Figura 4b, c).
Modelos possíveis das alterações estruturais dependentes da fosforilação dos criptocromos vegetais em resposta à luz azul. A região PHR é predominantemente carregada negativamente (-), e o domínio carboxi-terminal (C) pode ser feito negativamente carregado pela fosforilação (que requer ATP e libera fosfato inorgânico, Pi). Em todos os modelos, a fosforilação leva à ligação de parceiros de sinalização desconhecidos (X, Y, Z) e à regulação do desenvolvimento da planta. (a) Um modelo é que a fosforilação do domínio carboxi-terminal em resposta à luz é realizada por ATP ligado à região PHR; isto leva à dissociação dos dois domínios. (b) Uma segunda possibilidade é que a fosfo-transferência em resposta à luz envolve a interação de dois criptocromos codificados pelo mesmo gene. (c) Alternativamente, a transferência intermolecular de fosfotransferência pode envolver a interação de diferentes criptocromos. Todos os três cenários podem existir em células vegetais, e a atividade de um criptocromo pode ser determinada pela cinética das diferentes reações.