O que é a sequenciação em tempo real de uma única molécula (SMRT)?

Por Dr. Maho Yokoyama, Ph.D. Revisado por Christian Zerfaß, Ph.D.

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• Como funciona a SMRT Sequenciação em Tempo Real?
• Estudo da Metilação de DNA em Bactérias; uma Aplicação da Sequenciação da SMRT

A sequenciação de DNA funciona usando a polimerase do DNA para adicionar nucleotídeos a um modelo. Existem várias tecnologias disponíveis para o sequenciamento de ADN. Um exemplo é a sequenciação em tempo real de uma única molécula, ou sequenciação SMRT.

Pesquisador examinando o diapositivo de transparência da sequência de ADN. Crédito: Shawn Hempel /

Como funciona o sequenciamento SMRT?

Como com outras tecnologias de sequenciamento de ADN, o primeiro passo após a extracção de ADN é preparar uma “biblioteca”. Este processo prepara o ADN para a sequenciação; neste caso, são adicionados adaptadores a qualquer uma das extremidades de uma molécula de ADN duplamente encalhada, o que efectivamente permite que o ADN se torne num único modelo circular encalhado. Isto significa então que o DNA pode ser sequenciado continuamente.

Esta biblioteca de DNA, ou o DNA modelo, é então colocado num sequenciador de DNA que contém “guias de onda de modo zero” que têm a DNA polimerase imobilizada numa das extremidades. Uma única molécula de DNA é então imobilizada nestes guias de onda de modo zero, e a DNA polimerase começa a adicionar novos nucleotídeos a uma cadeia de DNA sintetizada de novo complementar ao DNA modelo. As bases destes nucleotídeos são rotuladas e a incorporação destas bases na cadeia de ADN em crescimento provoca a emissão de luz. Esta emissão de luz é então lida em tempo real, e como a emissão de cada base é diferente, isto permite que a base específica seja identificada.

A principal vantagem da sequenciação SMRT é a geração de leituras sequenciais longas de alta precisão, o que melhora a montagem de genomas inteiros. Isto porque as leituras de sequenciação mais longas significam menos “construção” para montar o genoma.

Estudo da Metilação de ADN em Bactérias; uma Aplicação da SMRT Sequenciação

O que é a metilação de ADN?

A adição de um grupo metilo ao ADN, também conhecido como metilação, ocorre em todos os reinos da vida. Existem três nucleotídeos metilados presentes nas bactérias; m5C (C5-metilcitosina, que também está presente nas eucariotas), m6A (N6-metil-adenina) e m4C (N4-metilcitosina, que só é encontrada nas bactérias). A metilação ocorre após a síntese de novas cadeias de DNA, e acontece em nucleotídeos específicos.

Os grupos metilo saem da dupla hélice do DNA, e portanto podem impactar a ligação entre o DNA e as proteínas de ligação do DNA. Isto, por sua vez, impacta processos incluindo a replicação cromossômica, a reparação da desadequação do DNA, bem como o tempo de transcrição do gene e formação de linhagens epigenéticas.

Mecanismos digeséticos: a metilação ou acetilação do DNA pode ativar ou não a transcrição do gene. Crédito da imagem: ellepigrafica /

Por que a metilação do DNA é importante nas bactérias?

As bactérias são infectadas por vírus, portanto precisam de um mecanismo de proteção para superar as infecções virais. É aqui que entram em jogo os sistemas de modificação de restrição; este sistema é composto por uma enzima de restrição, que decompõe o DNA em locais específicos, e uma metiltransferase de DNA, que adiciona um grupo metilo à adenina (A) ou à citosina (C).

Na maioria dos sistemas de modificação de restrição, a metiltransferase de DNA age para proteger o DNA bacteriano da enzima de restrição. A presença da metiltransferase de ADN significa que o ADN bacteriano se torna metilado, enquanto o ADN viral infectante não o é. Isto, por sua vez, significa que o DNA viral é degradado pela enzima de restrição, enquanto que o DNA bacteriano é protegido devido à enzima de restrição não agir sobre o DNA metiltransferase. Entretanto, deve-se notar que existem enzimas de restrição que atuam no DNA modificado.

Estudos recentes têm sugerido que pode haver papéis adicionais para sistemas de modificação de restrição. Por exemplo, a eliminação de certos sistemas de modificação de restrição resultou em uma mudança na expressão gênica, que está ligada à diferença na metilação do DNA. Os sistemas de modificação de restrição também podem causar quebras e mutações C-T de dupla cadeia, influenciando assim a evolução das bactérias. Mais recentemente, foram desenvolvidas tecnologias capazes de determinar a metilação de todo um genoma bacteriano, conhecido como “metiloma”.

Como se determina o metiloma utilizando a sequenciação SMRT?

Como a sequenciação SMRT fornece resultados em tempo real, pode ser utilizada para detectar modificações no ADN, incluindo a metilação. A polimerase de ADN incorpora nucleótidos a uma taxa constante, mas esta taxa pode ser alterada se o nucleótido no modelo tiver sido modificado. Isto pode ser notado durante o processo de sequenciamento.

Blow at al. usou o sequenciamento SMRT para mapear modificações de ADN em 230 microrganismos. As modificações que procuraram incluíam m5C, m6A e m4C. Os autores descobriram que 93% desses microorganismos mostraram metilação de DNA, e também encontraram 834 motivos que foram metilados. Isso permitiu aos autores identificar quais motivos são os alvos de 620 metiltransferases de DNA.

Interessantemente, os autores observaram que, embora 48% dos organismos estudados tivessem uma metiltransferase de DNA, não havia evidência de que uma enzima de restrição também estivesse presente. Portanto, é possível que a metilação do DNA tenha um papel importante na regulação do genoma, ou outro papel importante em microorganismos que ainda não foi identificado.

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Escrito por

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama é uma pesquisadora e escritora científica. Ela recebeu seu Ph.D. da Universidade de Bath, Reino Unido, após uma tese no campo da Microbiologia, onde ela aplicou a genômica funcional ao Staphylococcus aureus . Durante os seus estudos de doutoramento, Maho colaborou com outros académicos em vários artigos e até publicou alguns dos seus próprios trabalhos em revistas científicas avaliadas por pares. Ela também apresentou seu trabalho em conferências acadêmicas ao redor do mundo.

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